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討論串[求救] clone不出來
共 10 篇文章
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#5
Re: [求救] clone不出來
推噓1(1推 0噓 4→)留言5則，0人參與, 最新作者milkpa (風中狂歌的傻子)時間16年前 (2010/01/16 23:33), 編輯資訊
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使用的polymerase為何？. 使用前請先看datasheet，他會有一般的pre-heat/denature/anneal/extention的建議值有的1kb/1min，有的1kb/2min，有的1kb/15sec，這些都會影響產物. primer的Tm值多少，用這個才能推估你的anneal
(還有667個字)
#4
Re: [求救] clone不出來
推噓1(1推 0噓 0→)留言1則，0人參與, 最新作者bee921 (BEE)時間16年前 (2010/01/16 22:42), 編輯資訊
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以下是我的淺見 (供參考用 ^^"). 搞不好在高一點,就不會那麼多band Extension time過長容易有多個products 覺得可以增加你DNA量及正確性--. ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc). ◆ From: 140.112.84.225.
#3
Re: [求救] clone不出來
推噓4(4推 0噓 1→)留言5則，0人參與, 最新作者lail (逃避不是辦法阿)時間16年前 (2010/01/16 19:50), 編輯資訊
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有些地方我提供一點小小意見,供您參考^^. 既然很多條band，要如何肯定在位置差不多的那條band是所要的產物？. 如果不能確定，那即使做gel extraction也會挖到錯的DNA. 因為你是兩種酵素同時作用，如果可以，確認一下在你的實驗時要條件下. 兩個酵素同時作用時效力是可接受的. (我之
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#2
Re: [求救] clone不出來
推噓2(2推 0噓 2→)留言4則，0人參與, 最新作者wt1seven (PMS502)時間16年前 (2010/01/16 18:57), 編輯資訊
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PCR產物不是單一band，. 還往下做，那僅能說一先天不良！. PCR條件可以的話，還是再試一下，. 雜band儘量少一點，或是用切膠回收的當模版，. 切酵素時間也許可再延長一些。. 也許引子設計時的序列也影響到切的效率，. 一般catalog上都有不同限制酵素最佳反應序列的列表. 後頭那些方法中
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#1
[求救] clone不出來
推噓2(2推 0噓 12→)留言14則，0人參與, 最新作者jck0406 (jck)時間16年前 (2010/01/16 18:28), 編輯資訊
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最近clone一直出問題，所以想上來問一下大家的意見. 以下是我做clone的步驟. 1) PCR增幅出目標基因(約1000 bp). DDW 36.5. 10X buffer 5. dNTPs 4. Primer-R 1.5. Primer-F 1.5. DNA polymerase 0.5. 9
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