Re: 請問用T4 DNA ligase做blunt-end ligation
抱歉...我沒做過這個....
不過我剛剛看了一下內容...有一個疑問...
37度是補nick的溫度....
可是我沒看到dNTP或其他可補nick的東西....
我不明瞭nick要怎麼補起來....可以解釋一下嗎...謝謝..
※ 引述《Mares.bbs@ptt.cc (Mares)》之銘言：
> ※ [本文轉錄自 Biotech 看板]
> 作者: Mares (Mares) 看板: Biotech
> 標題: 請問用T4 DNA ligase做blunt-end ligation
> 時間: Mon Dec 5 10:28:02 2005
> 各位前輩大家好 想請教一個ligation的技術問題
> 我想把設計好的linker (一端blunt一端sticky, blunt-end的5'有接磷酸)
> 接上用HaeIII和RsaI切好(都是blunt-end RE) 去磷酸的的genomic DNA
> 不過試了幾次 最後用PCR檢查發現都沒接上去...
> 以下是我的recipe:
> step1. 16'C 20min
> step2. 16'C 30min
> step3. 37'C 20min
> step4. Goto step2, 29times
> step5. 65'C 20min
> end
> --------------------------------------------------
> concentration
> digested, CIP'ed genomic DNA 0.05 uM <--- 我知道很稀 不過沒辦法
> Tris-HCL 50 mM
> MgCl2 10 mM
> DTT 1 mM
> Bovine Serum Albumin 25 ug/ml
> linkers 2.5 uM <--- 文獻上說
> --------------------------------------------------- blunt-end ligation時
> linker:DNA fragment
> = 40 ~ 100:1
> 是最理想的濃度範圍
> 這裡我是用 50:1
> 16'C是T4 DNA ligase形成phosphodiester bond的作用溫度
> 37'C則是補nick的溫度
> 65'C 20min用來heat kill
> 我是用NEB的T4 DNA ligase
> reaction condition都optimize到廠商的建議濃度了
> 其中BSA雖然成份有Na+和PO4- 原理上會阻礙ligation的效率
> 但是濃度相當低 (而且是NEB自己官方的配方)
> 另外廠商的建議DNA濃度在 0.1~1uM之間
> 但是因為我的實驗題材DNA的取得困難
> 讓我的用量只能達到最小值的一半 (0.05uM)
> linker濃度也做了三組 50:1 80:1 和 100:1 連130:1都做了
> 還是接不上去
> 不知道問題是出在哪裡?
> 感謝 ~
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