Re: [求救]molecular cloningr
有幾個技巧可以試試看
1. 在pcDNA3.1上,你設計的 BamH1和Eco RV中間是否還有其他的enzyme切點
若有 可以再加另一個enzyme去切 可加強有ligation成功的plasmid數量
2. 還有ligation的時候,溫度,時間,insert & vector比例和額外的添加劑
都要做交叉測試,一般我們會同時做個4~5組,然後再transform.
3. 在transform的時候也要注意cell和加入的plasmid的比例,另外也可以問
問其他實驗室有沒有比較新鮮的compment cell.
這個地方測試看看就知道是不是基因本身有問題了~~
祝好運囉~~
Keivn
※ 引述《kws6874.bbs@ptt.cc (煜凱)》之銘言：
※ [本文轉錄自 Biotech 看板]
作者: kws6874 (煜凱) 看板: Biotech
標題: [求救]molecular cloning
時間: Wed Feb 20 23:56:40 2008
最近經由RT-PCR方式要 clone 一段1480bp的片段到pcDNA3.1(-)的vector上..
..
確認原先primer已設計Bam HI與Eco RV位置無誤外,另外還在尾端多增加7mers作為
提升PCR products digestion efficiency...
可是..藉由37度C最佳buffer作用2小時及純化後..再以insert:vector > 6的ratio進行
ligation及transformation竟然沒長半顆clones...實驗所使用的enzyme及competent
cells都已再三確認其功效無誤... 但試了幾次都結果失敗...
另外,則是以T-A cloning方式進行cloning... transformation結果是OK...也看到
colonies長出來.. 但經由藍白篩過濾挑選剩餘colonies進行PCR check ..始終沒挑到
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