[問題]請問如何將Bacillus進行原生質體轉型

看板Biology (生物學)作者judoking (出外的遊子)時間11年前 (2014/06/02 00:08)推噓0(0推 0噓 3→)

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【問題】：我先前有看過paper也有做過實驗,也有抽質體但是跑出來膠的結果都是刷一條, 想請問如何確定plasmid 有轉質進入bacillus, 跪求高手幫忙...... 【問題起因】：這是畢業論文的實驗內容, 小妹距離畢業時日不多,希望有神手能指點迷津【個人看法】：目前我已經有作出轉型株, 有先以lysozyme方式打破細胞抽取DNA 但是跑出來的結果都是刷一條沒有單一band 【參考資料/連結】：以下是我參考paper的protoplast方法 1.挑選單一菌落至10mL的PAB培養液中，於45℃震盪(150rpm)隔夜培養，之後以1/100的接種量，接種至新的50mL PAB培養液中，於45℃培養至OD600約1.5時，離心回收菌體。 2.將回收的菌體以5mL的SMMP buffer (1M sucrose、0.04M maleic acid及0.04M MgCl2‧6H2O， pH 6.5) 及4x PAB等體積混合回溶，之後加入5mg的lysozyme，置於37℃震盪(100rpm)水浴槽中反應，每隔15分鐘取15μL反應液，以顯微鏡觀察其原生質體產生的情形。 3.觀察至99%的細胞形成原生質體後，即於室溫下以3500rpm離心10分鐘，小心去除上清液，並以1mL的SMMP將回收原生質體回溶，置於4℃中備用。 4.進行轉形作用時先將適量的質體DNA與150μL置備好的原生質體混合，再加入450μl的PEG溶液立刻小心混合均勻，置於室溫中反應2分鐘，加入1.5mL SMMP buffer，混合。 5. 離心3500rpm 7分鐘，去上清液，再加入500μL SMMP於45℃中震盪(100rpm)培養2小時，取適量菌液塗抹於含適當抗生素的PAB平板，於45℃培養48小時，觀察轉形結果。再來這是我抽取質體方法 1.挑取單一菌落接種於含適量抗生素之NB培養液中，37℃ 150rpm o/n 2.取1.5ml菌液至微量離心管，離心3500rpm 10分鐘，收集菌液 3.取1.0ml TSE buffer(10mM Tris-HCl pH8.0 300mMNaCl 10mMEDTA)，離心 3500rpm 10分鐘，清洗菌體一次 4.將菌體懸浮於100ul solution A (10mM Tris-HCl pH8.1 50mMNaCl 10mMEDTA 20%sucrose)中並加入0.5mg lysozyme ，37℃靜置反應30min 5.最後加入200ul solution II 以下步驟如大腸桿菌質體抽取法相同 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 203.222.1.111 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biology/M.1401638883.A.30D.html ※ 編輯: judoking (203.222.1.111), 06/02/2014 00:19:36