protein-protein interaction--Tap-tagging

看板Biotech (生命科學)作者niolas (要如何能值得?)時間20年前 (2004/10/01 10:50)推噓2(2推 0噓 0→)

留言2則, 2人參與討論串1/1

先暫做簡介,以後有空在上來po詳細方法: Tap-tagging全名為Tandem Affinity Expression Purification, 一種很有效率的純化方法,順便可以釣出protein complex, 對於未知與其他蛋白作用的特定蛋白,這是個好方法, 而且純化出來的蛋白純~ 策略為: 1.在Target protein的C-terminal加上CBP(calmodulin binding protein), 再來是TEV site(可被TEV protease切斷),再來是protein A三個Tag的fusion protein, 用PCR放大此片段後(兩邊要有Target gene的部分片段做recombinent,有一種特殊的 plasmid叫pBS1479與pBS1539專門做這種方法),transform入yeast(我用Saccharomyces Cerevisiae modified strain)。 2.篩出菌後養大破菌,以超高速離心(不同蛋白不同條件)後取上清,跑含IgG的column,其目的為和Target protein最尾端的protein A結合,流洗完後拿TEV protease下column ,這時會發生什麼事大家很清楚,出來的液體只有Target protein和TEV protease與少部分non-specific protein。(由於protein A和IgG結合力非常強) 3.再拿此流洗液下第二道column,含Calmodulin beads(內含Ca2+離子),這時大家也知道會發生什麼事,就只有含calmodulin binding protein的Target protein會binding 上column,再用Native elution即可。出來的蛋白很純而且不破壞蛋白在cell裡和其他protein interaction的結果, 這個方法之前都是free的,網路上可以察到全部的方法,前陣子又要用時才發現設計的人跑去開生技公司,然後這個方法變成一套產品。下面的網站有詳細的做法,有興趣的就參考看看囉! http://www-db.embl-heidelberg.de/jss/servlet/de.embl.bk.wwwTools.GroupLeftEMBL/ExternalInfo/seraphin/TAPtagging.html ※ 引述《HIbaby (嗨北鼻)》之銘言： : 我都用ip啦同實驗室的學長有人用GST 有人用yeast two hybrid : 不過我不知道你說的物化方法是哪些可以舉個例嗎 : 印象中有用生物趕測器的方式來測蛋白質和受體間的結合力 : 當結合以後會有微電極產生 : 可以比較精確測得binding的強弱 : 這算物化法嗎? 如果你有興趣我再找相關paper給你看 : ※ 引述《baseguard (....NN )》之銘言： : : 各位在做研究時,測試protein-protein interaction 大概都是用什麼方法? : : yeast two-hybrid, GST(or orther tags) pull-down ,IP ... : : 這些我都用過...帶給我很大的困擾..各有各的麻煩 : : 似乎有人用比較物化的方式,可不可以分享看看? : : FRET? : : isothermal titration ? : : 因為本身都是用分生的做法 : : 希望一窺物化　生化領域的朋友的觀點 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.246.136