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[求救] western blot問題

看板Biotech (生命科學)作者 (soyokenny)時間1周前 (2024/12/17 18:56), 1周前編輯推噓4(4推 0噓 9→)
留言13則, 4人參與, 1周前最新討論串3/3 (看更多)
（手機排版 亂掉抱歉） 各位前輩先進大家好 最近在用western blot跑小分子蛋白（17kda) 但band總是跑出奇怪的形狀，如附圖（非常醜請見諒） https://i.imgur.com/7jeWYfh.jpeg
連internal control (42kda)都出現拖尾的現象，如附圖 https://i.imgur.com/frrTqXF.jpeg
我是使用15% SDS-PAGE 1.5mm 蛋白loading 10到30ug都試過，體積也是試過10ul-30ul 上膠用75v跑到上膠底端，下膠用100v跑到快跳海 Transfer是使用PVDF膜（methanol浸泡1分鐘），100v 90min（塞冰桶，拿出來液體是冰 的） Blocking用5% BSA室溫兩小時，一抗用BSA照data sheet 1:2000稀釋 4度overnight，二 抗也是照data sheet用BSA 1:2000稀釋，室溫兩小時，Blocking跟染抗的每個步驟中間都 用TBST wash三次，每次五分鐘，最後ECL 1:1配好加1ml壓片。 照上述過程都還是有相同的情況，本來懷疑是我製膠的問題，所以有試過用commercial g el也是相同情況，懷疑是transfer的問題所以有試過濕式跟半乾式，但也沒有改變。 麻煩各位先進前輩了！謝謝！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 101.10.5.157 (臺灣) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1734433015.A.28C.html
推
12/17 20:28, 1周前 , 1F
看起來是膠或是蛋白有問題。膠借別人的材料試試看，
12/17 20:28, 1F
→
12/17 20:28, 1周前 , 2F
或是請跑出來正常的人幫你配一片膠。另外蛋白質如果
12/17 20:28, 2F
→
12/17 20:28, 1周前 , 3F
是直接收沒定量或是組織檢體，建議重複冷凍後多煮幾
12/17 20:28, 3F
→
12/17 20:28, 1周前 , 4F
次。
12/17 20:28, 4F
推
12/17 20:30, 1周前 , 5F
阿阿，沒看到已經有用其他膠。那marker漂亮嗎，試試
12/17 20:30, 5F
→
12/17 20:30, 1周前 , 6F
看從蛋白前處理改善看看。因為從fig 2，可以看到跑
12/17 20:30, 6F
好的感謝
→
12/17 20:30, 1周前 , 7F
完膠的結果就很怪了。
12/17 20:30, 7F
推
12/17 21:20, 1周前 , 8F
看起來像樣品沒純化乾淨 很多時候如gDNA沒去掉 大分子會在
12/17 21:20, 8F
好的，我再試試DNase跟sonication
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12/17 21:21, 1周前 , 9F
跑膠時於上方拉扯而變成這種撕咬感
12/17 21:21, 9F
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12/17 22:03, 1周前 , 10F
42 kDa拖條除了DNA以外，還有可能是下太多蛋白了
12/17 22:03, 10F
一開始下10ug的蛋白，但17那條太少了看不到，42還是有拖尾的現象
→
12/17 22:04, 1周前 , 11F
你的 transfer buffer 配方是什麼？有加SDS嗎？
12/17 22:04, 11F
我是直接買bio-rad commercial 的transfer buffer來稀釋，沒有加SDS
→
12/17 22:07, 1周前 , 12F
順便問個你用的跑膠系統是哪個廠牌的？
12/17 22:07, 12F
跑膠、transfer的機器跟buffer都是用bio-rad的 ※ 編輯: soyokenny (123.195.77.180 臺灣), 12/17/2024 23:04:39
推
12/18 13:47, 1周前 , 13F
Marker如果沒歪樣本歪那就是 樣本前處理的問題吧
12/18 13:47, 13F
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