Re: [求救] western blot問題

看板Biotech (生命科學)作者antarestar (anta)時間13年前 (2011/09/30 13:26)推噓0(0推 0噓 1→)

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以下為個人經驗.. ※ 引述《JaShih (Sharon)》之銘言： : 最近做western blot一直做不出來，做得很挫折 T^T : 雖然之前也在板上爬過不少有關western blot的文 : 也試過不少方法 : 不過每次壓出來還是一片白..... : 希望版上大家可以幫我看看我的步驟上有沒有哪邊需要改的 : 謝謝大家 <(_ _)> : --------------------以上是前言分隔線XD----------------------------------- : 我要跑的蛋白質主要分子量分布為40-180kDa : separating gel用12% 如果要看到130以上有東西要分開最好是用6%gel : transfer membrane 是PVDF 我們家是用NC menbrane 可以少個methanal活化的步驟也很好transfer 缺點是太貪便宜常常會拿到coating不勻的產品 : transfer步驟: : 1.transfer 16V 1hr 4℃ 我們家固定先用350mA 120mins下去try 看結果再判斷要不要調condition : 2.blocking 1hr (5% non-fat milk in PBS) 聽說安佳很好用 : 3.一抗 4℃ O/N (稀釋1:1000-1:5000，主要以說明書為主) : 4.wash 10 min x 3次 : 5.二抗 RT 1hr (稀釋1:1000-1:5000，主要以說明書為主) : 6.同4 : 7.ECL作用數秒~3min後壓片要看你的protein好不好壓挑不同的ECL有不同的作用時間 pico:2min plus:1min femto:5min : 二抗的部分有洗過1hr.2hr.3hr : 但是都沒有壓出來 : 壓片的問題大部分是壓不出來 : 不過也有遇過幾次黑片的狀況 : 抗體廠牌... : 一抗大部分是R&D system，少部分是santa cruz : 二抗是santa cruz (之前爬文santa的抗體好像有點恩...Orz) 我家老闆是不喜歡santa都放4度但是santa便宜挑到某些產品還是很好用的 : 另外，想順便問一下 : Ponceau S有沒有哪一家比較便宜阿... : 之前問sigma的好貴又好大罐 = = " : 謝謝大家 >"< 我的習慣是會前後各load一條marker 直接判斷大小對著裁除非有特殊原因不然不太喜歡染那個通常看不到band 1.protein本身不好做 2.western condition不適合建議跟推文一樣看看b-actin等internal的成色怎樣再說 -- -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 211.76.175.171