[問題] 關於QIAGEN RNeasy kit抽tissue sample的問題

看板Biotech (生命科學)作者Ezc (買東西不能對店家太客氣!)時間19年前 (2007/01/11 01:57)推噓4(4推 0噓 1→)

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這問題困擾了小弟許久不過到目前想破頭仍然不知是為何所以上來請教各位先進最近得到了幾組臨床的tumor及鄰近normal sample，並使用QIAGEN RNeasy kit 抽RNA來跑RT-PCR，不過發生了一個奇怪的問題，就是抽了四組，每一組的 tumor抽出來都是260/280於2.0~2.1，260/230於2.0以上，品質應該還不錯，跑RT-PCR也都很亮，但是每組抽Normal時，全部都抽不出來，用的方法當然與抽tumor時一樣的，神奇的是測OD時260及280全部是0.000… 因此想了幾個原因 1 sample的RNA被degrade掉了：每組都是normal及tumor同時處理，要degrade應該兩個都抽不出來啊…? 2 tissue磨的不夠碎：已經盡全力磨碎了，但是就是tumor抽的好，normal抽不到 3 normal sample有問題：應該不太可能四組都是normal有問題…? 4 抽的過程出問題：不過已經完全遵照QIAGEN手冊上一步一步做加上考慮Trouble shooting的最好做法一樣tumor好normal不好其他有想過但覺得不太可能的原因 1 RNeasy kit放太久(四年以上) membrane變質造成抽不出來，但是應該不會運氣這麼好每次都是tumor用到好的… 2 normal含血造成RNA degrade 這個原因是唯一每組抽RNA時的共通點了，因為經由RLT lysis buffer+研磨棒+針筒均質後，都是normal的均質液較紅，而tumor較白，不過感覺有點沒道理orz 另外用Trizol抽竟然也有相似的結果，normal sample的RNA抽是抽的出來，品質就是沒有 tumor用trizol抽的好 (同重量normal 260/280~1.9，260/230~0.9 約3μg，tumor 260/280~2.0， 260/230~2.0 約30μg 差了十倍多orz) 希望有經驗的先進能夠指點一下謝謝!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 203.73.12.168