[問題] hydroxyapatite純化
想請問板上使用過這類層析材料的前輩
我利用這個材料想分離葉綠體-ATP synthase中的gamma subunit
我看paper的配方各種buffer的組成如下:
buffer A: 15mM NaH2PO4
1mM ATP
0.5mM MgCl2
2M Guanidine-HCl
buffer B: 15mM NaH2PO4
buffer C: 200mM NaH2PO4
buffer D: 300mM NaH2PO4
2M Guanidine-HCl
paper 內容提到說由buffer A 可以洗出alpha及beta subunits
利用buffer D可以洗出gamma subunit(我希望得到乾淨的gamma)
可是經過多次的實驗結果 在buffer A就已經將大部分的蛋白質都沖出來了
而在buffer D 所沖出來的是alpha beta 和gamma subunits
不過蛋白質濃度比由buffer A沖出來的來的低
我在想在buffer A就已經把大部分的蛋白質沖出來是不是因為加了Guanidine-HCl
破壞了蛋白質和gel的結合力
還是說流速太快(24cm/hr) 造成蛋白質來不及和gel結合就被沖出來了
我應該要如何改進才可以得到純的gamma subunit
煩請板上有類似經驗的前輩幫幫忙
謝謝你們
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