利用Real-time pcr的問題..
我是利用ABI -7300的機型 來做superarry的實驗
這個superarry 有96的孔盤 每個 孔盤 有不同的primer來做偵測!
所以 我只需要 把 cDNA 做出來 再與一些Superarry 中所付的kit(SYBR)
一起加入稀釋到一定的體積 然後 每個孔 加入25ul就可以 送入ABI-7300進行偵測!
所使用的Annealing 的溫度也是60度( 其實 在操作上 沒太大問題)
但 我想問問板上有經驗的高手.. (因為這是我第一次實驗呀)
1.通常 我在轉cDNA之前時 一定會測OD260/280 但我這種的sample 每次測出來
最高只有 1.6 有時 還會 掉到 1.4 好幾次 都是這樣了 (我的sample 是monocyte的成
份較多)因是是血液性 不知 是否是這原因 而造成 ratio值低，因為我抽其它細胞
就沒這種問題! 所以想問 是不是 ratio 值太低 所出來的real -time pcr 的data
就很難相信呢?
2.我這次的實驗分成兩組 (當然 一組是加藥(a)另一組是沒加藥的(b)
在這一個96well 的孔盤中 其中有五種不同的internal control
分別是 b-actin 、GAPDH、B2M、HPRT1、RPL13A(後三種我沒聽過)
出來的average 在這兩組中 分別差了 一個 Ct..就等於差了兩倍..
我整個就不知 該如何是好..在轉cDNA之前 我是有定量的..
但 如果 只單看 b-actin 在這兩組 就沒太大差別.
所以 我想請問的是 ..有什麼方便 可以使其定量 or normalization他們嗎?
就是 能夠讓他們 一起比較?(當然 要把interal control 用後人為的方式讓他們
一致化? 我想問specialist 但到現在 都沒回電..所以..心好急呀..
3.由於 這是第一次 做..
我在想請問..到底 是要差多少個 Ct 值 才算真正有差異性?
因為 superarry 的網站上 有附上 excel檔 讓我們 做 data的整理..
我輸入後..當然 有差異性的 會有數字上顏色的變化 好讓我們知道
是變多or 變少..而 這種敏感度 有辨法像是做 western blot 的方試知道
這種抗體的sensitivity 有多強嗎? ex:在GAPDH 來說 只要 2pg 就可偵測到 之類的
問題有點多..希望板上的人 能夠給些建議與指導...
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