請問一下有做過免疫沈澱（IP）的經驗的人....

看板Biotech (生命科學)作者ColdP (......)時間19年前 (2007/05/01 01:36)推噓3(3推 0噓 1→)

留言4則, 3人參與討論串1/1

我之前在用New England biolabs的protein G磁珠作IP 剛開始的時候還滿順利的，有些抗體真能抓到東西，而且在negative control中(只有sample和bead)，不會elute出任何東西...... 但是不曉得為什麼，最近我重複之前的實驗，卻不知為何開始出現問題了囧> 我的negative control中開始出現大量的non-specific binding，出來的pattern居然還和我的實驗組有些類似，這樣我不由地開始有些懷疑之前得到的結果了... 我仔細地翻閱了一遍自己之前的實驗記錄和data，老實說我現在的IP作法和之前的IP作法基本上是一樣的，但是我以前的negative control可說是相當乾淨，現在的negative control卻相當髒... 真要說作法有什麼不同，大概也只有我現在是用reuse的bead作preclear(不然太浪費了)，還有我剛作的時候沒有加入PIs(pepstatin A, leupeptin, benzamidine, PMSF) 這些有可能是原因嗎? 補充比較細節的部分，我用的IP buffer類似RIPA buffer: 10 mM Na2HPO4, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% NP-40, pH 6.3 wash次數為三次，都是用IP buffer進行wash, 基本上wash到第三次就已經 wash 不出什麼東西了.... elution buffer是0.05M diethylamine, 0.5% deoxycholate, pH 11.5. 老實說我都用了這麼強的IP buffer, 居然還會在negative control 看到non-specific binding實在讓我很吃驚 <囧> 由於整個實驗室就只有我在作這個東西，老闆對於這樣的現象也不知道為何會如此，希望有經驗的版友能夠分享一下可能的原因.... 謝謝! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.96.73