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[問題] PCR p不出來 >"<

看板Biotech (生命科學)作者 (逐風逐雨)時間17年前 (2007/07/24 21:43), 編輯推噓25(25推 0噓 19→)
留言44則, 19人參與, 最新討論串1/1
趁著暑假進實驗室做實驗， 目前要用pcr夾一段基因的promoter，大約2kb 夾了兩個禮拜，夾的很辛苦 = = 換了兩次primer 第一次： ======================== 滅菌ddH2O 28.5 λ exBuffer 10x 4 λ extaq 0.5 λ primer forward 2 λ (10μM) (Tm56) reverse 2 λ (10μM) (Tm52) template DNA 1 λ (買來的，不在手邊，濃度忘了= =) (human genomic DNA) dNTP 2 λ (2.25mM)(?) ========================= 雜band很多 但是好像有2kb的target(微弱) 做膠上回收2nd PCR卻又p不到 懷疑第一次p到的可能不是我要的target 後來有做human genomic dna電泳，雖然很黏但是沒有斷裂發生， 品質應該還可以 第二次： ======================== 滅菌ddH2O 30.5 λ for CG rich Buffer 4 λ (學長配的) r taq 0.5 λ primer forward 1 λ (10μM) (Tm64) reverse 1 λ (10μM) (Tm64) template DNA 1 λ (買來的，不在手邊，濃度忘了= =) (human genomic DNA) dNTP 2 λ (2.25mM)(?) ========================== 電泳跑完結果…. 乾˙乾˙淨˙淨!!!! 完全沒p到!!囧rz 有勞各位高手前輩幫忙看看 >"< PCR condition: (1) D 95℃ 3min D 95℃ 35sec A 48℃ 30sec E 72℃ 2min (5 cycle) D 95℃ 35sec A 55℃ 30sec E 72℃ 2min (30cycle) E 72℃ 4min (1) 2nd PCR D 95℃ 3min D 95℃ 35sec A 68℃ 30sec E 72℃ 2min (30cycle) E 72℃ 4min (2) D 95℃ 3min D 95℃ 35sec A 60℃ 30sec E 72℃ 2min (30cycle) E 72℃ 4min -- 有一些濃度忘記了或不確定...實驗記錄本目前不在手邊 >"< 有錯請指正!! 謝謝大家~~~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 122.124.28.174
推
07/24 21:47, , 1F
請不要說P不出來~會讓人家感覺你很不專業哦(題外話@@)
07/24 21:47, 1F
推
07/24 21:51, , 2F
唔...之前沒有接觸分生也沒有進實驗室過，不知道用語@@
07/24 21:51, 2F
推
07/25 00:25, , 3F
請用amplify...p不出來感覺很怪XD
07/25 00:25, 3F
推
07/25 00:52, , 4F
有時候ENZYME的品質是很重要的 我也遇過這窘境
07/25 00:52, 4F
→
07/25 07:00, , 5F
我的口委都是說 "P" 不 "P" 的出來說....
07/25 07:00, 5F
推
07/25 07:40, , 6F
我也習慣用"P"來形容
07/25 07:40, 6F
推
07/25 10:42, , 7F
口語常習慣說P不出來.跟專不專業無關.實驗做得出來就是
07/25 10:42, 7F
→
07/25 10:43, , 8F
專業. 做不出來,用語再精確也是枉然.
07/25 10:43, 8F
推
07/25 12:11, , 9F
用"夾"出來也不錯呀
07/25 12:11, 9F
推
07/25 12:37, , 10F
p +1 一三樓的 竟然這麼講究用詞專業 想必你們是箇中高手
07/25 12:37, 10F
→
07/25 12:45, , 11F
幫忙一下這位同學 決解他的問題 不然 只是一個會打嘴炮的
07/25 12:45, 11F
推
07/25 13:19, , 12F
P+1
07/25 13:19, 12F
推
07/25 13:40, , 13F
難道要說C不出來嗎 我c好久都c不出來是怎樣
07/25 13:40, 13F
推
07/25 13:47, , 14F
你的annelling的tm怎麼跳來跳去 到底是幾度?
07/25 13:47, 14F
→
07/25 13:47, , 15F
DMSO跟FORAMIDE分別拉一下gradient試試看
07/25 13:47, 15F
推
07/25 14:16, , 16F
第一次的tm比較低；2nd pcr學長姐說可以調高；
07/25 14:16, 16F
→
07/25 14:18, , 17F
第二次是因為新的引子TM較高，所以調高了~
07/25 14:18, 17F
→
07/25 14:19, , 18F
謝謝大家關心!! 目前還是失敗中~ (￣□￣|||)a
07/25 14:19, 18F
推
07/25 14:30, , 19F
要不要做做看taq的濃度梯度測試? 不然不知多少taq適合
07/25 14:30, 19F
推
07/25 15:31, , 20F
強烈建議加betaine試試看
07/25 15:31, 20F
推
07/25 19:04, , 21F
大概每個學校要求程度不同吧...........
07/25 19:04, 21F
推
07/25 19:16, , 22F
所以要戰學校嗎　
07/25 19:16, 22F
→
07/25 19:20, , 23F
annel時 要不要做個temp的gradient看看
07/25 19:20, 23F
推
07/25 19:29, , 24F
不敢....我只是個小小研究生~網路上"強者"太多了~我沒資格
07/25 19:29, 24F
→
07/25 19:30, , 25F
只是希望大家能建立正確的觀念~我也是被老師糾正過來的
07/25 19:30, 25F
推
07/26 08:35, , 26F
我認為提出建議用比較正確的術語沒有什麼不好的，做學術
07/26 08:35, 26F
→
07/26 08:36, , 27F
本來就要求精確，不然在國際會議上你也問人P不P的出來試렠
07/26 08:36, 27F
→
07/26 08:36, , 28F
試，人家以為你要小便還是怎樣。我不曉得那些針對一、三밠
07/26 08:36, 28F
→
07/26 08:37, , 29F
的建議做出刻薄回應的人心裡是怎麼想的。
07/26 08:37, 29F
推
07/26 14:10, , 30F
P就可以了
07/26 14:10, 30F
推
07/26 14:17, , 31F
建議你DNTP 10mM 0.5λ 10X buffer 2.5λ
07/26 14:17, 31F
推
07/26 17:54, , 32F
唉~有些人就以為實驗做的好就是專業~殊不知推理和思考才是
07/26 17:54, 32F
→
07/26 17:54, , 33F
做學術研究的精要~只會技術你跟機器有什麼分別?
07/26 17:54, 33F
推
07/26 23:07, , 34F
所以推理和思考完 都不用做實驗來證明嗎
07/26 23:07, 34F
→
07/26 23:09, , 35F
沒有好實驗技術 要如何來證明你的推理和思考
07/26 23:09, 35F
→
07/26 23:10, , 36F
那最後不就又只是空想 最後不能畢業就做數據嗎
07/26 23:10, 36F
推
07/27 12:47, , 37F
只是好奇 請教V大 DNA電泳跳海 你們都怎麼說呀??
07/27 12:47, 37F
推
07/28 14:12, , 38F
dear ivan:你使用的PCR條件是之前有成功過嗎?若是沒有
07/28 14:12, 38F
→
07/28 14:16, , 39F
那我也如前面幾個人建議的一樣,先測一下primer在不同
07/28 14:16, 39F
→
07/28 14:17, , 40F
溫度下amplify的結果,必要的話再加上切膠定序初步確認
07/28 14:17, 40F
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07/28 14:18, , 41F
primer有沒有問題,因為pcr最容易發生問題就在於primer
07/28 14:18, 41F
→
07/28 14:20, , 42F
能否正常的binding上target site...加油
07/28 14:20, 42F
推
07/31 14:10, , 43F
to van:所以用語(p或amplify)可以代表推理和思考的能力
07/31 14:10, 43F
→
07/31 14:11, , 44F
原來這就是貴校的教育啊，在下受教了
07/31 14:11, 44F
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