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[方法] 還有哪些方法可以避免pcr時發生突變？

看板Biotech (生命科學)作者時間18年前 (2007/10/20 02:20), 編輯推噓8(8推 0噓 4→)
留言12則, 5人參與, 最新討論串1/1
如題 我能想到的只有 很pure的template(ration約1.9) 乾淨的水 低的cycle數(我用25個cycle) hi-fidelity的enzyme(我用的是finnzyme的phusion搭配GC buffer) 4K多的產物還是有大約10個突變 還有哪些方法可以改進呢？ 謝謝！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.230.179.75 ※ 編輯: mojimoji 來自: 61.230.179.75 (10/20 02:20)
推
10/20 03:05, , 1F
你的反應相當不正常 error-prone pcr 也才 0.66%~1%
10/20 03:05, 1F
→
10/20 03:06, , 2F
你用high-fidelity enzyme居然可以到 0.25%...
10/20 03:06, 2F
→
10/20 03:06, , 3F
先去檢查你的buffer, MgCl2...有沒有問題吧
10/20 03:06, 3F
推
10/20 03:09, , 4F
Mg2+過高 突變率會大幅增加
10/20 03:09, 4F
推
10/20 06:01, , 5F
dNTP mix 的量也會影響 PCR 的準確率 (只是影響比較小?)
10/20 06:01, 5F
推
10/20 08:54, , 6F
我也是覺得error-prone很高 可是原廠buf Mg濃度會不好??
10/20 08:54, 6F
推
10/20 10:46, , 7F
看看你是不是有搞錯濃度之類的 dNTP mix如果是unbalance
10/20 10:46, 7F
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10/20 10:47, , 8F
影響會比較大
10/20 10:47, 8F
推
10/20 10:57, , 9F
如果你的片段不是GC rich，建議用該kit附的HF buffer
10/20 10:57, 9F
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10/20 10:58, , 10F
該kit的GC buffer錯誤率比HF buffer高
10/20 10:58, 10F
推
10/20 14:26, , 11F
template的序列有確認過嗎 會不會原本就是錯的
10/20 14:26, 11F
推
10/22 22:44, , 12F
基本上樓上說得可能信我都有排除～ 還有什麼方法呢！
10/22 22:44, 12F
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