[心得] 以Real-time PCR偵測 microRNA

看板Biotech (生命科學)作者soom時間18年前 (2007/11/21 15:54)推噓5(5推 0噓 4→)

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最近花了一點時間在測試matured miRNA的PCR偵測法有點心得可以跟大家分享由於miRNA是只有23~27 nt大小的RNA片段無法直接使用一般PCR去偵測，所以必須要想辦法將之延長常見的作法是接上linker或者使用特殊的RT primer 我們Lab試過的方法有兩大種，都包括Kit以及後來自行modified的方法第一種是先將RNA用Poly A polymerase加上oligo(A) 然後用加上linker的oligo(dT)RT primer做fisrt-strand synthesis 如此做出的cDNA大致上會到80~90 nt 之後就可以使用matured miRNA的sequence當作forward primer (當然，U要用T代替)，Linker上面的sequence當作reverse primer 就可以進行SYBR green I based 的qPCR 這種方法的Kit 可以參考I廠的 nCode 第二種是使用特殊的stem-loop RT primer 此RT primer全長約50 nt，前面6 nt需要和目標miRNA互補，後面則形成stem-loop的結構這樣子產出的cDNA是約~75 nt 可以使用位於stem-loop中間偏後位置當reverse primer miRNA扣除末5 nt的sequence當作forward primer 也是一樣可以進行SYBR green I based的qPCR 而若是需要probe，可以取miRNA跟RT primer間的sequence 這種方法的Kit請參考A廠的Taqman assay 把各種方法特點表列如下第一種 | 第二種 | poly A required x RT-primer universal specific F primer specific specific R primer universal universal 使用時的感覺，若是使用primary tumor cell 則會發現第一種方法的melt curve非常混亂但是stem loop法就比較單純的單一波峰，做出來的SD也比較小若把kit也考慮進來的話大致上用起來的感覺是 (註: 此為本人使用心得，不一定具代表性) 優 >>>>>>>> 劣價格 I廠 <= 1 < 2 << A廠 SD A廠 < 2 < 1 = I廠時間 A廠 <= 2 < 1 = I廠偵測能力 A廠 = 2 >>> 1 = I廠 C/P值 2 > A廠 > I廠 > 1 若是預算不用考慮的話，A廠會是省時間的好選擇若是有時間設計primer的話 2 可能是比較好的選擇以上所述歡迎多多指教鞭笞若是有需要RT primer的sequence可以再找我參考資料: 1. http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/16271.html 2. Caifu Chen, Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 20 e179 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.77.155