[討論] 關於PCR的一些問題
各位好
我做PCR大概也有數十次了
但有一些疑問讓我蠻困惑的 一直不曉得如何去解釋
因此希望能跟各位討論看看
第一、
在一個可成功擴增的PCR反應中
如果把PCR的cycle數提高為什麼反而會使產物減少甚至消失？
cycle提高酵素活性降低、錯誤率提高、PCR達飽和我覺得都合理
但太高反而讓產物降低我倒是怎麼想都覺得奇怪
是因為產物被降解？
還是...（自己亂想的）
產物在多餘的cycle中denature之後
因產物濃度太高而黏不回去或亂黏 使得major band變得不明顯？
第二、
PCR的產物究竟是否可以用"同一組"primer再擴增一次？
我曾經這樣做過 但會造成smear的現象
如果smear是因為受先前PCR reagent的影響
那我只要將產物稀釋到適當的量 就可以再跑一次PCR？
如果不行或效果不好 為什麼？
我想nest PCR可以跑出更漂亮的結果 那為什麼同一組primer不行？
有聽過是因為primer binding的位置的說法
同一組的primer annealing的位置太靠近template的末端
所以不好進行PCR
這樣的說法對嗎@@?
第三、
關於3'RACE的問題
mRNA以poly d(T) primer進行RT之後的cDNA
應該用forward primer + poly d(T) primer就可以夾出片段吧？
可是有人這樣做出來過的嗎？
市售RACE kit使用anchor primer
是因為poly d(T) primer其Tm值太低的關係？
以上幾個粗淺的問題
希望有人能為我解答@@
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.64.93.103
※ 編輯: Fourfish 來自: 61.64.93.103 (03/30 15:52)
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