[討論] 定序時條帶太淡了怎麼調整?

看板Biotech (生命科學)作者 (或許天堂也常日落)時間18年前 (2008/04/16 15:53), 編輯推噓4(407)
留言11則, 4人參與, 最新討論串1/1
我的實驗室是專門做植物萃取的實驗 最近在定序上發生了一些小問題 我實驗的物種大致有三種---海茄苳,銀葉及水芫花(均為濱海樹種) 海茄苳的定序一直都很好沒有問題 但頭痛的是銀葉和水芫花的定序條帶都很淡 送定序時常因訊號太弱而失敗 首先,我可以確定pcr程式是沒有問題的,primer、dntp、taq和buffer都沒有問題 (因為海茄苳都定的出來!銀葉和水芫花也偶爾定的出來~) taq  0.4 buffer 5 dntp 2 primer 2 primer 2 水 36.6 tdna 2 total 50 請問我應該怎麼調整呢??? 麻煩大家提出些意見參考~~謝謝! -- 遺憾提醒我們曾經幸福的可能 但 我們畢竟是錯過了! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 211.75.55.226

04/16 15:54, , 1F
ps產物50ul中我會load 10ul去跑膠,有BAND我才送定序!
04/16 15:54, 1F

04/16 16:01, , 2F
PCR產物最好先經過clean up再送定序!!
04/16 16:01, 2F

04/16 16:02, , 3F
你的10ul band多亮阿~~~如果淡淡的!那產物濃度真的不高~
04/16 16:02, 3F

04/16 17:33, , 4F
有時候淡有時候很亮.....
04/16 17:33, 4F

04/16 18:23, , 5F
做完PCR反應,clean up 回溶25ul,提高濃度
04/16 18:23, 5F

04/16 18:24, , 6F
load 3ul check的band普通亮,這樣定序通常都ok
04/16 18:24, 6F

04/16 18:27, , 7F
暴力一點也可以做兩三管Clean up成1管,但如果專一性不夠
04/16 18:27, 7F

04/16 18:29, , 8F
這時候雜band的濃度也一起被提高了...
04/16 18:29, 8F

04/16 18:31, , 9F
dNTP 2mM可以加到5ul做看看
04/16 18:31, 9F

04/16 19:15, , 10F
EtBr染色步驟有固定?
04/16 19:15, 10F

04/16 19:19, , 11F
tDNA 1ul或更少0.5ul
04/16 19:19, 11F
文章代碼(AID): #181R1uiT (Biotech)
文章代碼(AID): #181R1uiT (Biotech)