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[求救]請問一下純化inclusion body的方法@@

看板Biotech (生命科學)作者 (人真好!)時間18年前 (2008/04/23 18:41), 編輯推噓6(6推 0噓 11→)
留言17則, 7人參與, 最新討論串1/1
請問一下各位@@! 我在純化inclusion body時 (我的protein帶有His-tag) 破完菌，離心完後取沉澱物 以含有1% Triton X-100之buffer洗完五次後 再用不含1% Triton X-100洗完最後一次後 離心取沉澱加入含有6M Gu.HCl之buffer 然後放在室溫下旋轉到明天 隔天後，離心取上清加入Ni-NTA agarose 旋轉隔夜後 以含有6M Gu.HCl之buffer (含有10mM, 100mM, 500mM imidazole)流洗之 後來取5ul以bradford assay都測不到蛋白質 但是flowthrough的部分卻很藍! (但是我發現流洗的時候Resin的顏色變成了白色的了!@@) 我猜測是不是Resin內的Ni已經被流洗掉而失去功能了~ 還是說這一個Resin無法耐到這麼高的濃度? 如果我改用HisTrap FF的管柱不知道行不行的通~ (我有去查Manual，裡頭說可以耐到4~6M的Gu.HCl) 如果改用成8M Urea會改善嗎? 謝謝各位囉^^ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.79.199
推
04/23 20:27, , 1F
理論上用 imidazole 流洗下蛋白質後 Ni 還會留在 column
04/23 20:27, 1F
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04/23 20:28, , 2F
所以變白是不正常的 再來就是 你的 gel 跟 GE 的
04/23 20:28, 2F
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04/23 20:29, , 3F
不見得一樣 所以我也不知道他能耐到多少
04/23 20:29, 3F
推
04/23 22:46, , 4F
我用過磁珠純化過inclusion body 效果很好 可以試試
04/23 22:46, 4F
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04/23 23:13, , 5F
請問磁珠是怎樣的純化方式呢? @@!
04/23 23:13, 5F
推
04/23 23:41, , 6F
buffer pH 檢查一下, 可能變太大了...
04/23 23:41, 6F
推
04/24 01:04, , 7F
那個wash的imidazole的濃度是參考廠商說明書的建議?
04/24 01:04, 7F
推
04/24 01:12, , 8F
先配好1M imidazole stock solution, pH要調到8.0左右
04/24 01:12, 8F
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04/24 01:15, , 9F
cell lysate裡頭不能含有EDTA或EGTA ，因為會吃掉Ni
04/24 01:15, 9F
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04/24 01:18, , 10F
Ni-NTA purification under protein denaturation conditon
04/24 01:18, 10F
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04/24 01:21, , 11F
是不需要用imidazoole的....最好先詳讀manual
04/24 01:21, 11F
推
04/24 08:24, , 12F
假如沒記錯 Ni-NTA manual不建議用這麼高濃度GnHcl
04/24 08:24, 12F
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04/24 08:24, , 13F
可試8M Urea 另外和gel incubate後 wash前的flowthrough
04/24 08:24, 13F
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04/24 08:25, , 14F
有留下來檢查嗎? 可排除在binding step就出問題的可能性
04/24 08:25, 14F
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04/24 08:26, , 15F
另外Ni-NTA純化denature蛋白質是可以加imidazole的
04/24 08:26, 15F
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04/24 08:26, , 16F
manual上雖沒建議但若有其他non specific binding
04/24 08:26, 16F
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04/24 08:27, , 17F
也可加
04/24 08:27, 17F
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