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[求救] 又是PCR!兇手是primer嗎?

看板Biotech (生命科學)作者 (yuki)時間18年前 (2008/05/30 11:58), 編輯推噓15(15推 0噓 19→)
留言34則, 13人參與, 最新討論串1/1
小的幾乎每天都要PCR 手上也很多組primer都要P 可是目前就是有2組primer最討厭了~很奇怪~ 狀況就是: negative ctrl 一直有band!!(污染???) 請廠商合成的primer, dilute成10X後的冰-20C 剛開始dilute成1X的冰4C, 現在也改冰-20C 可是都是廠商送來後使用第一次dilute的primer P出來都OK neg ctrl空空如也! perfect!! 可是到了要P第二次/第三次時 neg ctrl就出現band了! 重新從10X dilute的也一樣(有時候又OK~~) 重新請廠商合成的狀況也一樣: 收到primer --> dilute 10X [in Hood(嚴重到連dilute都在hood裡進行了!), 分裝成很多小管, 冰-20C] --> dilute 1X --> PCR OK!(neg ctrl 沒有出現) 隔天, 重複使用1X的繼續P第二批 --> 有時候OK, 有時候不OK!! 第三批 --> 肯定不OK!! 重新從10X再dilute 1X, 幸運的話, 第一次OK, 第二次OK/不OK, 第三次不OK 不幸運的話, 連第一次也都不OK! 剛開始1X我都會dilute成100ul, 現在已經減少到50ul... 已經試過了很多遍了, 也絕對不是buf, dNTP, H2O的問題... 因為有試過用同樣的buf, dNTP, H2O, 別組primer都很正常! pipet照UV, tip, epp都是用剛滅菌沒開過的! 就只有特定的那2組primer才會有這樣的狀況! 請問有沒有高手知道問題在哪裡?? primer設計不良??穩定性不夠?? (會造成neg ctrl出現band??) 廠商的問題??合成不夠純?? (重新合成也一樣??別組primer同廠商也沒問題) 甚至請別家廠商合成同一組primer狀況也一樣! 兇手就是primer本身了吧??? 可是primer我是照paper提供的阿~?! 有沒有人可以幫我看一下primer本身有沒有問題啊?? primer A 5': 5'-ACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAG-3' 3': 5'-CTCGCGGATGGCGCTGAGGCC-3' primer B 5': 5'-CTCGGGTGTTCCGGCAAACTG-3' 3': 5'-CGCAGAGGAAGCTGGAGAAAG-3' 救救我吧!我真的快被搞瘋了!! 先叩謝了!!! Orz -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.15.154.12 ※ 編輯: yukilee 來自: 163.15.154.12 (05/30 12:11)
推
05/30 12:18, , 1F
戴手套做實驗看看
05/30 12:18, 1F
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05/30 12:22, , 2F
我都有戴啊~@@"
05/30 12:22, 2F
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05/30 12:24, , 3F
狂噴酒精,戴口罩,關冷氣,在hood裡配都試過了!一樣!
05/30 12:24, 3F
推
05/30 12:55, , 4F
電風扇不要開 不要說話 確定所有東西都有滅菌完全嗎？
05/30 12:55, 4F
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05/30 12:56, , 5F
BAND的大小 還是其實是primer dimmer?
05/30 12:56, 5F
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05/30 13:34, , 6F
就跟target band一樣大,時淡時亮,跑過快要跳海了還是存在!
05/30 13:34, 6F
※ 編輯: yukilee 來自: 163.15.154.12 (05/30 13:35)
推
05/30 13:51, , 7F
借別人家實驗室配一次PCR看看...連水都跟他們要
05/30 13:51, 7F
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05/30 13:52, , 8F
曾經有聽過水被某東西汙染把PCR搞得人仰馬翻的事
05/30 13:52, 8F
推
05/30 14:59, , 9F
好p的sample就沒有那條band？反之則會明顯出現？
05/30 14:59, 9F
推
05/30 16:19, , 10F
pipetman.....可能有污染........
05/30 16:19, 10F
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05/30 16:29, , 11F
有試過固定同一個sample P, pipet都有照UV overnight
05/30 16:29, 11F
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05/30 16:33, , 12F
試過同樣的水同樣的pipet,不同的primer是OK的!
05/30 16:33, 12F
推
05/30 19:27, , 13F
不同的primer當然可能會夾不到東西...
05/30 19:27, 13F
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05/30 19:28, , 14F
一定要....換水換實驗室換工具!!!!!
05/30 19:28, 14F
推
05/30 21:40, , 15F
用別的pipette試試看，或是用有濾膜的tip。
05/30 21:40, 15F
推
05/30 22:34, , 16F
要不要....換個人換個實驗室P看看？
05/30 22:34, 16F
推
05/30 22:50, , 17F
primer本身或許就已經污染了~
05/30 22:50, 17F
推
05/30 23:33, , 18F
我P不同的primer都會換手套耶
05/30 23:33, 18F
推
05/31 04:34, , 19F
最大的可能就是水，不同primer當然不一定會有產物
05/31 04:34, 19F
推
05/31 06:09, , 20F
不放template，primer...等，下去跑跑看，一樣一樣抓....
05/31 06:09, 20F
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05/31 06:10, , 21F
以前被這樣搞過，轉基因的assay negative都是band......
05/31 06:10, 21F
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05/31 06:11, , 22F
後來抓到是廠商送來的dNTP原液污染....一整個無言.....@@
05/31 06:11, 22F
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05/31 10:36, , 23F
回以上部分:我的template是病人血液的DNA,每個病人都要
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05/31 10:38, , 24F
不同的primer然後再分析SNP,所以換primer P是一定會有產物
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05/31 10:40, , 25F
的,我上面的OK不OK是指neg ctrl有沒有band,沒有band是OK
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05/31 10:40, , 26F
不知道我的表達方式大家有沒有看懂~@@~
05/31 10:40, 26F
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05/31 10:43, , 27F
我也都有換pipet換bench還跑到hood裡做過了~~><~~
05/31 10:43, 27F
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05/31 10:47, , 28F
回O大:我有試過neg不加primer,結果當然是沒有band,所以應
05/31 10:47, 28F
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05/31 10:48, , 29F
該其他東西buf,dNTP等都是正常的吧??!!
05/31 10:48, 29F
推
05/31 15:04, , 30F
產物多大?
05/31 15:04, 30F
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05/31 16:00, , 31F
primerA 265bp, primerB 72bp
05/31 16:00, 31F
推
06/01 01:25, , 32F
你的NC會部會只是dimer?
06/01 01:25, 32F
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06/01 08:45, , 33F
6F回答過了......
06/01 08:45, 33F
推
06/04 01:05, , 34F
polymerase contamination? 我們lab有遇過^^"
06/04 01:05, 34F
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