[求救] RACE 的問題已爬文~

看板Biotech (生命科學)作者gwendiline (丹丹)時間18年前 (2008/05/30 13:58)推噓0(0推 0噓 2→)

留言2則, 2人參與討論串1/1

小妹目前在作RACE~ 已經是第三run~ (每次試驗都有重新抽RNA) 但發生的問題依然相同~~ 先請看圖~:) http://www.wretch.cc/album/album.php?id=gwendiline&book=34 相簿敘述有詳細說明~ 我使用Clonxxxx的kit~ specific primer設計也沒問題當初已確定定序的基因片段是mRNA 序列而並非另一股DNA序列因此是根據mRNA序列去設計的primer~ 並且也先和一般cDNA(非RACE cDNA)進行PCR 可成功夾出我要的片段~ 而問題如圖所示 5'-RACE 出現像dimer的片段 (我姑且稱為dimer~) 3'-RACE 則出現smear~ 當初我預估整個基因組大約2Kb 因此PCR program： 94℃ 30 sec 60℃ 30 sec 72℃ 3 min 共 35 cycle~ Anealing temp. 偏低 (Protocol 建議 68℃) 原因在於我的primer Tm 僅有52℃ 已考慮加長primer至建議的maximun 28 mer (目前僅有24 mer) 但基本上60℃做得出來再往上就不確定了爬文雖得不到答案但引起我ㄧ些思考 3' RACE的部份：有板友說smear 是因為基因組太長所以做出許多大大小小片段 (該板友是回答5' RACE smear的問題) 去NCBI查過其他植物相同基因組大概2~3 kb 而這3' RACE被夾出的片段也僅佔所有基因組的一部份 extension 目前已經3分鐘故我推測這樣的時間應該是夠長的.. 當然我也還沒有試更長還希望板友給意見~~ 或許真的是時間不夠長的緣故 5' RACE的部份：底部出現像dimer的小片段我已經將我的primer和所有會加到的primer進行比對 (肉眼 + 軟體) 基本上是ok的~ 因此我判斷底部的小片段可能是沒辦法接上的primer所聚集的片段或是錯誤的小產物~ 但如果是這樣是什麼原因造成呢? (為什麼會接不上~> <~) 先前我曾經根據我的primer 設計anealing temp 那時候是55℃ 但仍然有相同問題... 所以應該不是anealing temp 太高的關係吧(?) 以上是我的問題還請各位前輩能分享經驗幫助我解決~~ 感激不盡~~:D -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.192.30

[求救] RACE 的問題 已爬文~

[求救] RACE 的問題已爬文~