[求救] 如何研究某蛋白的功能是estrogen receptor dependent的
如題
想請教版友
已知protein A是一DNA methyltransferase (well known)
目前有一新發現:estrogen receptor alpha(ERa)與E2 (estrogen receptor的ligand)結合後,
會recruit 好幾種蛋白與protein A結合在 pS2 promoter上, 同時
此promoter上的5-mCpG發生demethylation; 作者另外以in vitro的方式
發現protein A具有deaminase的能力, 可以將5-mC變成T
附註:1. protein A: Dnmt3a及Dnmt3b, 已知的DNA methyltransferase, 會促使
C變成5-mC
2. pS2(TIFF1):已知的estrogen receptor alpha target gene, promoter上有
estrogen response element
3. 已知estrogen receptor alpha會與TDG(thymine DNA glycosylase)結合
,所以作者推測 Dnmt3a與(或)Dnmt3b造成5-mC的deamination變成T, 造成
mismatch, 進而由TDG及其他相關蛋白進行base excision repair
4. 以前沒有發現過Dnmt3a或Dnmt3b具有deaminase的能力, 只知
DNA methyltransferase activity
5. 加入ICI 182780(estrogen receptor alpha的antagonist), 會使ERa及
Dnmt3a.Dnmt3b都不能結合到此promoter上
因此, 我想探究為什麼Dnmt3a及Dnmt3b在此情況下能做deamination,進而引起
DNA demethylation
我的推測:Dnmt3a及Dnmt3b具有deaminase activity, 參與在DNA demethylation是
estrogen receptor alpha dependent
目前遭遇的困難: 要如何證明Dnmt3a及Dnmt3b具有deaminase activity是因為ERa
將他們聚集到此promoter上之後, 才具有這樣的功能
我想應該無法使用將ERa knockdown或是ERa antogonist的方式,
因為如果ERa不存在或是ERa不能作用, 則Dnmt3a及Dnmt3b就無法
bind上此promoter,就無法證明是否:
"Dnmt3a及Dnmt3b具有deaminase activity是因為ERa
將他們聚集到此promoter上之後, 才具有這樣的功能"
可是我又想不出有什麼方法或策略可以證明.研究
所以想請版友提供我一些想法及建議 謝謝
拜託拜託 謝謝大家
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