[求救] western blot偶爾會有背景超高的情況

看板Biotech (生命科學)作者LIAR (墮天使)時間17年前 (2008/10/21 23:55)推噓2(2推 0噓 0→)

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我最近在跑western，用的membrane、抗體都很固定，基本上也都OK，只是在少數時候會發現整片膜發光的情況。由於我是用UVP的CCD照的，如果是壓底片的話，應該就是所謂的「壓海苔」了！ HTTP://MYHOME.ETHOME.COM.TW/liar2000/080912_p-ERK,ERK.png HTTP://MYHOME.ETHOME.COM.TW/liar2000/080912_p-ERK,ERK_W.png 上面是PVDF 0.45um，下面是0.22um，轉印時兩張墊一起，看有沒有轉過頭。我一轉印完就先剪成圖中的4小張，再丟blocking一小時，然後同一個位置的 0.45um和0.22um的PVDF在一抗時就放同一袋，室溫搖一個半小時。之後WASH和二抗就大家一起搖。從照片來看，上面的0.45um應該問題不大，但下面的0.22um卻不曉得為什麼，就是有不均勻的亮。 HTTP://MYHOME.ETHOME.COM.TW/liar2000/080923_ECL2.png 跑三種單株抗體，除了一抗不一樣有分開外，其餘步驟包括blocking和wash等都一起做。這一次全部是PVDF 0.45um，blocking,一抗二抗都70 min。問題就是最下面那兩張，根本是破表了。 HTTP://MYHOME.ETHOME.COM.TW/liar2000/081021_beta-ACTIN.png HTTP://MYHOME.ETHOME.COM.TW/liar2000/081021_beta-ACTIN_W.png 這一次是做stripping後重新blocking(over night)開始，結果也是有一片區域爆亮。由於同一張照片中，blocking是大家一起，應該不會有問題。而一抗我也用很多次，有的甚至是reused的，所以專一性也沒問題。可是也不應該是wash不乾淨，我拿回去重洗再照，還是同一個區域亮。請問我的問題是出在哪裡，應該要怎麼修正呢？ -- 太初有道，道與耶和華同在，道就是耶和華。這道太初與耶和華同在。萬物乃藉祂所造，凡被造的沒有一樣不是藉著祂所造的。生命在祂裡頭，這生命就是人的光。光照在黑暗裡，黑暗卻不接受光。吾輩乃生於黑暗，行於黑暗。因神之指引，行向光明；又因撒旦誘惑，回歸黑暗。我不斷地徘徊於光明與黑暗之間，從被造之日至今，又自今直到那審判之日的來臨。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 123.192.22.47