[求救] 請問有實驗室有proline嗎 要做bacillus的competent cell
打算作bacillus megaterium的competent cell
以為藥品都準備好了
結果少了proline><
有人在新竹可以借我1g嗎
星期一可以歸還(sigma的)
還是有其他amino acid適用的話可以告訴我嗎
很想趕快知道transform的結果QQ
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把步驟寫出來
其中有什麼不妥的地方
也請大家不吝指教
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藥品配製:
1.2X AB3(antibiotic medium NO3):7g溶於200mL水中 高溫滅菌
2.2X SMM: 1Msucrose 40mM sodium maleinate 40mM MgCl2 pH=6.5 高溫滅菌
1+2等體積混合得SMMP
3.PEG-P:40% PEG6000 in SMMP
4.CR5 topagar 500mL:
a.10.2g sucrose 3.25g MOPS 0.33g NaOH pH=7.3 體積250mL 高溫滅菌
b.2g agar 0.1g casmino acid 5g yeast extract 體積142.5mL 高溫滅菌
c.57.5mL 8X CR5 salt 25mL 12%proline(過濾) 25mL 8%glucose(過濾)
CR5 salt 8X stock(625mL):1.25g K2SO4 50gMgCl2．6H2O 0.25gKH2PO4 11gCaCl2．H2O
5.將a跟b混合維持50度C 再加入b維持42~43度C
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protoplast 製備
1.將B.megaterium single colony 接進50mL LB medium 培養至OD600=1
2.3000rpm 25度C 離心10分鐘 除去上層液 以5mL SMMP回溶
3.加入Lysozyme 10mg 37度C 70rpm 震盪120分鐘
4.3000rpm 25度C 離心10分鐘 除去上層液 以5mL SMMP回溶 再次離心 除去上層液
5.加入含有10% glycerol的 SMMP 回溶菌體 每500uL分裝成一管 -80冷凍
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Transform
1.取0.5~1 ug DNA 與500uL protoplast混合 加入1.5mL PEG-P 放置室溫2分鐘
2.加入5mL SMMP 3000rpm 25度C 離心10分鐘 除去上層液 以0.5mL SMMP回溶
3.37度C 70rpm培養120分鐘
4.取2.5mL CR5-top agar 於無菌試管中,加入50uL菌液
5.將菌液塗在含tetracycline的LB agar plate 37度C培養12~24小時
6.將菌落於兩天內在新的培養基上塗開
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.113.224.228
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