[方法] 設計跨Intron primer的方法

看板Biotech (生命科學)作者andy731 (闇黑小喵喵)時間16年前 (2009/04/03 01:53)推噓3(3推 0噓 0→)

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1.先在data base上找到目標基因的genomic gene 序列及目標基因的mRNA 序列 2.將兩序列儲存至同一個文字文件 ( .txt檔 ) 3.利用Bioedit軟體將兩序列開啟 4.執行軟體上方sequence選項內的Pairwise alignment裡的 Align two sequences(optimal GLOBAL alignment) 選項 5.待軟體計算完，即可得到 genomic gene序列 + 已經對齊好的 mRNA序列 Ex: genomic ACGTATTGTCAACTGAGCGATCTCCGTAAAGTTAGTTCGATCACACGTCAGCTACGATCTCGTA mRNA ACGTATTGTCAACTGAGCGATCTC------------------------------CGATCTCGTA ^^^^^^^^^^^^ ^^^^^^^^ (12 mer) (8 mer) AT: 8 mer CG: 12 mer CG% = 60 % primer序列:CTGAGCGATCTCCGATCTCG 6.primer設計技巧設計此primer是為了要避免掉genomic DNA的干擾 Taq在合成PCR產物時靠的是primer 3'端是否有黏接完全，換句話說~3'端若是沒有黏接DNA template即無法合成出產物因此在設計primer時，可採用5'端序列長度較長(約10~14個mer) 3'端序列較短(約8~10個mer)，而本人習慣設計高GC比(約55~65%間) 因這樣annealing溫度可以提高，增加primer專一性，且可以排除那些3'端黏合在模板上的機率。另外，需注意primer設計時序列會不會自行黏合，也盡量避免設計到迴文序列，基本上這樣的primer專一性都會很高。另外補充 1.AT在計算Tm值時皆算2度 CG 4度所得的溫度減5度，即可當做抓最適條件時annealing的溫度 2.設計Antisense時，請記得將該序列反轉並倒寫正常序列 Ex.CTGAGCGATCTCCGATCTCG 反轉+倒寫 CGAGATCGGAGATCGCTCAG ------------------------------------------------------------------------ 因本身是非生技本科系學生，一路走來真的很辛苦，也碰到很多挫折因此，提供一些基本知識來讓像我一樣背景的同學能夠讓實驗快速上手祝大家早日脫離苦海吧!! 特別聲明本方法可允許轉載編輯，但請註明來源作者 -- ※ 編輯: andy731 來自: 192.83.195.230 (04/03 02:09)