[求救] Recombinant protein和預期的大小不一致

看板Biotech (生命科學)作者egoweaver (Hiko)時間17年前 (2009/05/07 20:03)推噓3(3推 0噓 5→)

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最近在做recombinant protein，primer夾的序列translation之後預期的大小是18.5KDa 表現質體用pET30a，restriction enzyme用BamHI/EcoRI從已定序沒有錯誤的TA vector subclone進去，再用restriction enzyme切割跑膠確定有insert。之後transform到BL21(DE3)裡面表現。在pET裡表現出來預期是~26KDa。可是出來的產物，直接拿crude lysate去跑SDS page卻看到產物在~34KDa的地方，而且用 Ni column沒有辦法純化出來(東西全都在flow through)。因為primer是之前在實驗室的學姊設計的，所以回頭檢查是不是open reading frame出問題，但是沒出錯。學姊之前也是做到這一步卡住，產物也是在34KDa…… 同樣的insert也subclone到pGEX裡，但是大小和預期一致，只是在inclusion body裡純化不出來。兩個問題： 1.有什麼原因會讓蛋白比預期還大嗎？或者那根本就不是我的蛋白(但是induction之後確實是多出那條band……) 2.純化不出來跟我一開始沒過filter就進column有關係嗎(學長說這樣column就報廢了囧) 內容很亂，請多包涵…… -- 即使消失也無妨全部重新開始也無所謂封上的心情與溫暖的肌膚令人無法理解而混沌不明是可以替很久以來我已遺忘天使與魔鬼在耳邊的低語代的接納自己的焦躁與醜惡是無與倫比的美麗但是誰來需要我吧害怕受到傷害其實我感受得到除了這一切一切以外你的存在我相信心情變差了希望有誰來束縛我信任你擁有所剩的不過是兩肩上灰色的黯淡人影羞惡之心與尊嚴拒絕一直這樣下去於是更為恐懼無比的希望下一個破壞差異與隔閡分辨善惡之能力智慧與機巧然後走向夢絮絮聒聒的要我如何如何罷了與風的彼側來吧即使我的世界因此破碎。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.121.97