PTT職涯區 / Biotech (生命科學)

[問題] western blot的transfer問題

看板Biotech (生命科學)作者 (究極掰)時間17年前 (2009/05/13 14:08), 編輯推噓15(15推 0噓 11→)
留言26則, 8人參與, 7年前最新討論串1/1
最近剛開始做western blot 第一次做的時候 是請別實驗室的同學帶我做一次 所以protocol也依照他們 最後壓片的結果很不錯 但是後來我自己重做的時候 壓片的結果很糟 那時認為是transfer buffer有問題 因為其他人也transfer的不太好 所以就重新配buffer 第三次我再做的時候 transfer完 我看prestained marker有完全tran過去 不過後來我把那塊gel拿去染&退染 發現與我一起跑對照的gel bend差不多濃 最後我壓片也沒東西 ------------------------------以上是事情的經過------------------------------ 我的疑問是 prestained marker已經tran過去了 為什麼我load的protein沒有tran過去呢? 會是我protocol的問題嗎? 還是我要再加別的東西到transfer buffer裡 (原來只是1X TBE) 我是用80 mA for 80 min, 第三次用的PVDF是45 um (第一次是0.2 um) 請大家給我一點意見 謝謝@@ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.99.25
推
05/13 14:23, , 1F
methanol?
05/13 14:23, 1F
推
05/13 14:34, , 2F
semi-dry?我是用170mA 60min 溼式transfer則是250mA 1Hr 4度C
05/13 14:34, 2F
→
05/13 14:35, , 3F
PVDF membrane 要先用MeOH活化 NC membrane好像就不用 是嗎?
05/13 14:35, 3F
推
05/13 14:38, , 4F
恩 NC只要先浸泡一下transfer buffer就可以了
05/13 14:38, 4F
推
05/13 14:40, , 5F
嗯嗯 BTW .45um的抓不到12kD以下的蛋白 小分子得換.2的
05/13 14:40, 5F
→
05/13 15:35, , 6F
不好意思 我第三次是用NC membrane 也有先泡tran buffer
05/13 15:35, 6F
→
05/13 15:36, , 7F
不過我想prestained marker都有tran過去 (最小10 kD)
05/13 15:36, 7F
→
05/13 15:36, , 8F
所以我不曉得是什麼原因
05/13 15:36, 8F
推
05/13 20:45, , 9F
Transfer buffer有沒有加MeOH?
05/13 20:45, 9F
推
05/13 22:05, , 10F
都沒有人注意到TBE？
05/13 22:05, 10F
推
05/13 22:27, , 11F
我是用CAP或Towbin轉 但是原PO既然standard能轉過 我想應
05/13 22:27, 11F
推
05/13 22:28, , 12F
該不會是buffer的問題吧? 除非轉完染膠 膠上也可以染到St
05/13 22:28, 12F
推
05/14 11:14, , 13F
TBE...嗯 轉DNA!?
05/14 11:14, 13F
推
05/14 12:31, , 14F
western應該是protein吧 還有如果你用的不是gradientPAGE
05/14 12:31, 14F
推
05/14 12:33, , 15F
分子量會影響轉膜的速度喔 時間可能要靠抓的
05/14 12:33, 15F
推
05/15 02:07, , 16F
分子量多少阿? 可以把轉印buffer裡的甲醇提高到15%
05/15 02:07, 16F
→
05/15 02:08, , 17F
PAGE要泡一下轉印buffer membrane也要泡一下甲醇
05/15 02:08, 17F
→
05/15 02:09, , 18F
至少10 min吧 可讓大和小分子轉印速率不要差太多
05/15 02:09, 18F
推
05/15 13:26, , 19F
樓上說的方法是一般固定%數的膠可以用的嗎???
05/15 13:26, 19F
推
05/15 13:59, , 20F
我不是很確定 我也不知道原理是什麼 但我可以告訴你
05/15 13:59, 20F
→
05/15 14:00, , 21F
我的條件 我跑15% 分子量 15 kD 50以下幾乎可以一起
05/15 14:00, 21F
→
05/15 14:01, , 22F
轉過去 大分子的至少可以轉一半左右吧
05/15 14:01, 22F
→
05/15 14:03, , 23F
然後我是用0.45um的PVDF 0.22um太貴Lab又很少人用
05/15 14:03, 23F
推
05/15 14:04, , 24F
轉高分子提高SDS 低分子MeOH
05/15 14:04, 24F
→
11/11 01:28, , 25F
轉高分子提高SDS 低 https://daxiv.com
11/11 01:28, 25F
→
01/03 16:55, 7年前 , 26F
嗯嗯 BTW .45u http://yofuk.com
01/03 16:55, 26F
‣ 更多 georgeby 的文章
文章代碼(AID): #1A2cFg0r (Biotech)
Biotech 近期熱門文章
更多 近期熱門文章 >>
PTT職涯區 即時熱門文章
更多 即時熱門文章 >>
‣ 更多 georgeby 的文章
文章代碼(AID): #1A2cFg0r (Biotech)