[討論] 請教大體積的蛋白質表現
各位好
我目前在學習重組蛋白質的表現與純化
Host為E. coli (BL21 DE3, B834, Rosetta等strain)
最近常發生一個問題...
在做小量(~3ml LB)的蛋白質表現測試的時候 (抓表現的condition，包括溫度、OD、時間、IPTG)
可看到蛋白質表現的不錯
不過以同樣condition 將culture體積放大到~1或2L時
蛋白質表現量就會變得少 有時候甚至沒有表現
這樣表現時好時壞 讓人蠻頭痛的...
所以想請教有相關經驗的前輩
還有什麼因素是需要注意的嘛？
或者可以分享作法讓我參考及修改嘛？
希望能和各位討論討論 謝謝！
Vector: pET系列
Tag: 6xHis
以下是我目前的作法 [一些查到或打聽到的方法]
1. 沾取一點glycerol stock接種於LB(+antibiotics)中 37度 O/N culture 12-16hr
[a.有人建議不要用glycerol stock做start culture，至少用plate劃開挑single colony]
[b.從transformation做起]
2. 1 liter新鮮的LB(+antibiotics)加入10ml的O/N culture 37度 培養至OD ~0.4-0.6
[a.培養基要pre-warm]
[b.逐步放大體積 例如3ml -> 20ml -> 1L 以保持菌新鮮]
3. 調整溫度、加入1-0.5mM IPTG
[a.調整溫度後約10-20min 待適應溫度後再加IPTG]
4. 表現3-5hr 收菌 以SDS-PAGE確認蛋白質表現
對於我的作法和我打聽到的一些方法
希望大家給我一點意見 謝謝！
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.94.204
※ 編輯: Fourfish 來自: 140.116.94.204 (08/17 20:54)
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