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[求救] TA cloning

看板Biotech (生命科學)作者 (火球連發~)時間16年前 (2009/11/15 15:14), 編輯推噓6(6推 0噓 14→)
留言20則, 9人參與, 7年前最新討論串1/1
請問各位高手 我要把一段PCR產物(2.4K)放到pDrive cloning Vector 先使用TAKARA LA Taq獲得2.4 kb 的產物,電泳切膠, 再使用BioKit clean/Gel Etraction Kit回溶膠體 最後用水回溶 然後使用QIAGEN PCR Cloning KIT pDrive cloning vector 1ul PCR product 4ul ligation master mix 2X 5ul ----------------------------- 10ul 放4度冰箱overnight 再使用益生的勝任細胞YE607去做轉殖 冰上 5 min 42度 45 sec 冰上 5 min 再去塗plate (LB-amp)藍白篩選 隔天長出的大部分是藍色的4~5顆 白色只有一顆 經抽質體後質體大小約在2 kb BamHI XhoI 截切後出現3條片段約 2.1kb 3.3kb 3.8kb 與預期的3.8kb 2.4kb不同 請問是哪出了問題? ligation在16度會比較好嗎? 謝謝! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.35.109
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11/15 17:03, , 1F
vector:insert比例不對?
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11/15 17:14, , 2F
我照他protocal寫加1~4ul 想說應該也沒差成這樣吧@@
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推
11/15 19:28, , 3F
A tailing?
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11/15 19:29, , 4F
應該要像一樓說的那樣吧! Insert的使用濃度
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推
11/15 19:31, , 5F
喔 用LA tag做就是 ligation 沒有用過4度C 是建議的嗎
11/15 19:31, 5F
推
11/15 20:27, , 6F
兩個問題: 1.ligation用4度有點怪~我都用16度或直接室溫
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11/15 20:29, , 7F
2. heat shock完放完冰上,有要加medium長20分嗎?
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推
11/15 20:39, , 8F
commercial competent cell可不用recovery
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推
11/15 20:57, , 9F
建議 PCR 如果是 single band 就直接用 clean up
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11/15 20:58, , 10F
因為 A tail 用 gel extraction 很容易掉
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或是三樓說的做 A-tailing
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11/15 21:26, , 12F
他建議溫度寫4~16度都可以, LA Taq產物就是A tail了
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11/15 21:28, , 13F
他不是single band所以要用沏膠的
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11/15 21:29, , 14F
恩 這是commercial competent cell 不用recovery
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11/16 00:55, , 15F
建議gel extraction之後再做加A tail的那一步
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還有TA cloning應該可以在室溫放5 mins ligation
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推
11/16 01:08, , 17F
同意樓上的看法 膠體純化之後再A tailing試試
11/16 01:08, 17F
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11/18 15:58, , 18F
謝謝 我試看看~
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11/11 01:50, , 19F
1.ligation用 https://daxiv.com
11/11 01:50, 19F
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01/03 17:03, 7年前 , 20F
因為 A tail 用 https://daxiv.com
01/03 17:03, 20F
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