[求救] Ligation一直失敗
目前vector是4kb的pACYCDuet-1，
insert是2kb的PCR product，尾端有多設計2個nucleotide給RE作用
反應時一端為blunt end，另一端是sticky end
ligation前，確定電泳上的大小正確
ligation條件是：
Vector:insert約1:5
16℃ over night
Fermentase ligate 5ul
目前重做兩次
挑出來的clone都是Vector only
感覺insert沒有接上去
因為同時做的另一組方法完全一樣
只是Vector不一樣(insert類似)，已經成功做出來了
pACYCDuet-1在電泳膠上看大小是2kb
但用RE切一刀後會回到4kb
可能表示pACYCDuet-1易有supercoil
不知道會不會影響ligation？
目前想到的辦法可能是在ligation時加入PEG
或者換成其他cloning site
但總覺得跟問題無關
麻煩大家幫我看看... >.<~~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 122.120.34.115
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