[求救] 請問一下貼盤細胞收蛋白
請教一下各位學長姊!
我所養的細胞是黑色素細胞Melanocyte，他是一種貼盤細胞！
之前做Western收蛋白時，都是利用trypsin打下後，離心去除trypsin及medium後，用PBS
wash後，再依pellet大小判定加入RIPA的體積，濃度都可以收的蠻高的。
可是後來因為要看細胞中Rho,Rac,cdc42的磷酸化表現,以觀察藥物細胞filopodia的形成
情形！
我查paper的結果，filopodia生成到結束大約在兩分鐘內！
所以我設計了一組實驗，打算分別以藥物作用0,2,4,6,8分鐘，然後收取蛋白做western
由於細胞自體平衡機制的關係，我擔心以trypsin打下細胞，光trypsin作用的時間，
細胞就會自體平衡，使得最後磷酸化情形不明顯！
所以我是將medium吸掉，用冰的PBSwash後，加入RIPA於冰上作用10分鐘後，直接將細胞
刮下收蛋白,問題是蛋白的濃度都相當的低,皆不到1mg/ml...
請各位學長姊救救我..已經試了一個多月..還沒辦法改進!!謝謝!
註:細胞是種於10cm的dish，大約8分滿時，收蛋白
RIPA成分:Tris-HCL 50mM
EDTA 1mM
NaCl 150mM
NP-40 1%
Triton 1%
還有protease inhibitor
以及Phospo stop
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 210.64.98.254
→
11/01 11:48, , 1F
11/01 11:48, 1F
→
11/01 11:59, , 2F
11/01 11:59, 2F
→
11/01 12:06, , 3F
11/01 12:06, 3F
→
11/01 12:08, , 4F
11/01 12:08, 4F
→
11/01 12:08, , 5F
11/01 12:08, 5F
→
11/01 12:10, , 6F
11/01 12:10, 6F
→
11/01 13:11, , 7F
11/01 13:11, 7F
→
11/01 13:12, , 8F
11/01 13:12, 8F
推
11/01 16:35, , 9F
11/01 16:35, 9F
推
11/01 20:41, , 10F
11/01 20:41, 10F
→
11/01 20:41, , 11F
11/01 20:41, 11F
→
11/02 00:29, , 12F
11/02 00:29, 12F
→
11/02 00:31, , 13F
11/02 00:31, 13F
→
11/02 00:33, , 14F
11/02 00:33, 14F
→
11/02 00:34, , 15F
11/02 00:34, 15F
→
11/02 00:35, , 16F
11/02 00:35, 16F
→
11/02 00:36, , 17F
11/02 00:36, 17F
推
11/02 00:51, , 18F
11/02 00:51, 18F
→
11/02 00:51, , 19F
11/02 00:51, 19F
→
11/02 00:52, , 20F
11/02 00:52, 20F
→
11/02 00:53, , 21F
11/02 00:53, 21F
→
11/02 00:53, , 22F
11/02 00:53, 22F
推
11/02 05:10, , 23F
11/02 05:10, 23F
→
11/02 05:10, , 24F
11/02 05:10, 24F
→
11/02 11:39, , 25F
11/02 11:39, 25F
→
11/11 01:49, , 26F
11/11 01:49, 26F
→
01/03 17:02,
7年前
, 27F
01/03 17:02, 27F
→
01/03 17:02,
7年前
, 28F
01/03 17:02, 28F
Biotech 近期熱門文章
PTT職涯區 即時熱門文章
72
111