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[討論] 有用KpnI/BglII很難ligation的八卦嘛..??

看板Biotech (生命科學)作者 (～四條魚～)時間16年前 (2010/03/07 02:05), 編輯推噓7(7推 0噓 13→)
留言20則, 5人參與, 最新討論串1/1
我這陣子在建立promoter assay要用的plasmid Vector是pGL3-basic 要接進去的insert長度有800bp - 1.5kb Vector跟insert我都用KpnI + BglII (NEB)做double digestion 3hr 用gel extraction純化後做ligation 4度C O/N 結果transformation都沒colony....= =a 比例我從5:1抓到2:1 (insert:vector) 沒用... Vector用量從20ng做到100ng 也沒用.... 所以我一直在懷疑是不是KpnI/BglII就是比較難ligation?? 有沒有其他板友有這種經驗的？ (用pGL3有神祕技巧?? 或曾經也覺得某些RE做clone不太好做的...??) -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.64.93.103
推
03/07 07:23, , 1F
問八卦可以去八卦版啊....
03/07 07:23, 1F
推
03/07 08:24, , 2F
16度O/N ?? ration用1:10 ?? 兩個我的建議
03/07 08:24, 2F
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03/07 08:24, , 3F
final transform recover 用SOC
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推
03/07 08:27, , 4F
blunt end ligation用的comptent cell品質要好
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03/07 08:28, , 5F
阿 沒事把BglII看成另一個Orz
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03/07 11:24, , 6F
16度O/N我是沒試過 不過我做其他vector4度O/N都還OK 所以
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03/07 11:25, , 7F
這應該不是問題 請教用SOC recover的好處或幫助是..@@??
03/07 11:25, 7F
推
03/07 13:46, , 8F
to express more antibiotic proteins in short time
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推
03/07 13:49, , 9F
trouble shoot: digest kpnI or BglII individually, seeing
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if either of them is dead.
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03/07 13:50, , 11F
recheck if you are using correct antibiotic for selection
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03/07 13:51, , 12F
recheck if your insert DNA has both RE sites at ends.
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03/07 13:52, , 13F
ask another labmate try it for you
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03/07 16:53, , 14F
感謝上面各位 我曾想過是不是insert的promoter影響菌生長
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03/07 16:53, , 15F
特別是antibiotic protein 所以我會試試用SOC作recover
03/07 16:53, 15F
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03/10 12:04, , 16F
實驗結果是...換成SOC也是沒用 XD
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推
03/10 14:24, , 17F
你要先考慮的問題是RE到底有沒有切好
03/10 14:24, 17F
推
03/24 03:04, , 18F
pGL3-basic我也接到快爛掉= =已經接了40多個construct
03/24 03:04, 18F
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03/24 03:05, , 19F
我是用1:6的molar ratio vector用50ng
03/24 03:05, 19F
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03/24 03:06, , 20F
我是用NheI BglII的切點
03/24 03:06, 20F
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