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[討論] 抽膜蛋白

看板Biotech (生命科學)作者 (昂 布拉股)時間15年前 (2010/06/29 20:28), 編輯推噓3(3推 0噓 12→)
留言15則, 5人參與, 最新討論串1/1
最近老闆想要看蛋白translocate到膜上 他給我的方法是 用含有protease inhinitor的 1mM Tris作為低張溶液將細胞刮下 Vortex後 作用5分鐘 脹破細胞 離心5000rpm 5分鐘 收集上清液 pellet再用1mM Tris Vortex後作用5分鐘 重複 作用=>離心 步驟三次 三次的上清液去超高速離心45000rpm 75min 離下來的pellet為membrane fraction 上清液為Cytsol 收下來的membrane目前看起來是沒問題 可是cytosol protein定量出來超低 Western跑出來目標的protein也完全沒有訊號 目前懷疑可能原因是細胞並沒有脹破的完全 請問版友們有沒有甚麼這方面的經驗可以提供改進 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 120.126.49.21
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06/29 21:11, , 1F
上清液體積太多? 細胞太少?
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06/29 22:23, , 2F
不會耶 我以前用過同樣體積的lysis buffer收起來是沒
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06/29 22:23, , 3F
問題的
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推
06/29 22:48, , 4F
如果有預算 Thermo 的 Mem-PER Eukaryotic Membrane
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06/29 22:48, , 5F
Protein Extraction Kit 可以考慮一下
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06/29 22:49, , 6F
http://ppt.cc/LiHe 還有一些 substructure 可以參考
06/29 22:49, 6F
推
06/30 08:08, , 7F
用一組貴貴的douncer來弄破細胞膜 再用顯微鏡看
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06/30 13:49, , 8F
對阿 有人建議我用douncer 可是不知道那一根要多少
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06/30 13:50, , 9F
現在再想如果用30號針頭收吸把細胞弄破會不會好點?
06/30 13:50, 9F
推
06/30 19:47, , 10F
你的離心速度換算成g是多少? 太低是離不開的
06/30 19:47, 10F
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07/01 01:16, , 11F
剛算了下應該是72000g左右
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07/01 01:17, , 12F
我用離下來的pellet去跑是有東西的 但是就是cytosol
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07/01 01:18, , 13F
的protein量超低 我覺得這點比較詭異
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07/02 00:28, , 14F
我手邊的paper離膜蛋白都至少上到10g喔,給你參考
07/02 00:28, 14F
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07/02 00:29, , 15F
10萬g...
07/02 00:29, 15F
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