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[求救] 請幫我檢視抽RNA的流程!

看板Biotech (生命科學)作者 (koalawoman)時間15年前 (2010/09/11 16:05), 編輯推噓11(11推 0噓 55→)
留言66則, 9人參與, 最新討論串1/1
昨天我以為我改了很多地方應該會成功，但我還是失敗了，我決定打一下流程，請大家幫 我解惑和檢視 收菌:昨天我以為我已經改了很多部分應該會成功，但今天狀況一樣糟，我決定來打一下流程 收菌: 菌液+MEDIUM+藥混合養DISH裡6小時，把細菌刮下來收在eppendorf裡→離心→去上清液→ 再pellet裡加入1XPBS IN DEPC-H2O→冰-80冰箱 (這樣做細菌不會破裂嗎?我以前做細胞都是用抗凍劑，細菌也需要嗎?) 抽RNA:(抽完的RNA代號x，要不然之後會看得霧煞煞) 將昨天凍的菌拿出來解凍放冰上，加入200ul lysozyme+10ul lysostaphin作用兩個小時 大概每15分鐘會去翻轉eppendorf，之後用geneaid的Total RNA Mini Kit 是照廠商的 protocol(網址: http://www.geneaid.com/products_content/33/100/ )操作，可是沒 在冰上在室溫，抽完之後取7ul出來用nanodorp測RNA含量 結果很可怕: A RNA含量 260/280 222.9 2.26 219.5 2.03 230.1 2.18 B 22.4 2 22.3 2.03 22.1 1.94 我是想要拿1ug去RT但現在這樣就已經品質不好了，所以之後的流程就沒再做下去! 針對今天的可怕結果，我去問對面實驗室的學長，他覺得沒滅菌就已經是個大問題， 另外，他說操作KIT時也要在冰上，離心機一定要預冷4度c(我是在室溫)，還要把kit裡的 buffer們拿去預冷，這是他給我的建議，所以我現在把器具趁老闆不再拿去滅。明天照他 的建議在做一次! 之後的流程也請大家幫我看一下是否有問題? dnaes treat : 總體積10ul 10x buffer 1ul dnase 2ul RNA取1ug的量 剩下用DEPC-H2O去補 37度C 1小時→加入1ul stop solution→65度C 10分鐘 目前為止體積是11ul,取1ul出來之後會用(把這1ul代號Y) reverse transcription: 上個步驟剩的 10ul 2.5mM dNTP 5ul random hexamer 0.5ul 混合→65度C 10分鐘→冰上兩分鐘→繼續加入 RNA inhibitor 1ul 5xbuffer 5ul MMLV 2ul DEPC-H2O 1.5ul 以PCR機器去RT 25度 10分鐘→42度c 90分鐘 →95度c 5分鐘 →保存在4度 RT完的產物(Z) PCR的部分有點複雜 template 1ul 也就是把xyz各取1ul出來 25mM dNTP 1ul 10mM F-primer 2ul 10mM R-primer 2ul 10xbuffer 2ul 2.5mM tag 0.3ul ddH2O 11.7ul 去跑PCR→Agarose gel→染EtBr 之前的結果也很可怕: x(RNA) 有band y(DNase treat RNA) 有淡淡的band 跟X再相同位置→不應該有 Z(cDNA)沒有band→應該要有 請幫我看一下，感謝!!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.25.94.144
推
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你是在冰上操作嗎?
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以做細胞的來說（抱歉我沒做過細菌）先倒掉medium
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用ice PBS wash 2次後, 直接加入抽RNA的reagent 刮細胞
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整個過程冷凍次數愈少愈好
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另外, Dnase也會殺掉近乎一半的RNA,
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不管抽出來濃度 ratio如何 先跑張1% agarose gel
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推
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這加抽DNA的KIT我用過不錯，RNA的我就不曉得了@@
09/11 18:19, 7F
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09/11 18:22, , 8F
看看RNA degrade的程度吧（16s 23s rRNA??）
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09/11 18:29, , 9F
去除DNA污染可以用AluI這個酵素（只切雙股DNA）
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PROTOCOL 你可能要自行上網搜尋
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geneaid protocol上破菌好像沒那麼久？
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09/11 18:58, , 12F
破菌的部份，跟KIT不一樣，我從廠商的STEP2開始，因為
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老闆說菌的關係!
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我只有在破菌是再冰上，其他是在常溫，所以全程都應該
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在冰上是嗎???
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破菌的時候,RNase就會跑出來（別人的paper也是這樣做嗎?）
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盡量全程on ice
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破菌的方法是跟別的實驗室問的!
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同樣這隻菌?
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對!是一樣的菌!
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推
09/12 00:25, , 21F
我有個問題..為何收菌後不現抽呢?
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推
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如果要用kit抽,就不用前面冷凍及lysozyme破菌的動作了,
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如c大所言,直接抽反而更好,kit如果沒強調一定要在低溫或是
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不要,那是否全程冰上應該沒差,只有最後回溶離心後要低溫,
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另外,別兼實驗室如果操作這隻菌沒問題,是否可以請老闆讓你
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過去見習一下別人如何做?確實一破菌RNase就出來了,所以一
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般可在此步驟加proteinase K.另外,我覺得破菌時間真的有點
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久. 不過不太懂 RNA A及B差別為何? A明明有且純??
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推
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nanodrop可直接測出ng/ul,用1.5ul去測即可吧?7ul不心疼嗎?
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推
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如果別間實驗室用同樣kit抽的出來，我覺得你還是去看一下他
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們是如何操作的...不然我覺得傳統trizol就很好抽了
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步驟也沒這麼多～但其實我們都會盡量全程冰上操作
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然後我也覺得lysozyme處理有點久耶～這株菌這麼難破壁嗎
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推
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lysozyme真的處理有點久..破菌後RNase就放出來了
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09/12 03:46, , 35F
RNA 15分鐘就會被吃光.試試別的破菌法? 超音波.冷凍解凍.
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另外kit多少會有dna殘留 原核的話還是dnase一下比較保險
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Dnase inactive建議用PCI/CI 65度C下Rnase活性會出來
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你說dnase完RT還會有band 這有點怪...dnase是哪一牌的阿?
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最後RT完沒有band...這原因就很多了..
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不知有沒有RNA抽完直接跑膠的圖可以看一下?
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見習這事我有跟老闆說過，但沒下文，我也很無法，至於
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7ul則因為我測三次啦!，老闆說要三次平均!
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破菌的時間和方法是老闆跟對面問的，對面做最好的一次
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是同樣方法且時間更久!
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我不知道DNase是哪個牌子，我今天會去看一下!
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因為收菌前還有PRTREAT一些東西，但我下次會直接收完
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就抽!
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mattmatt:意思是我在DNasetreat時，會讓rnase活化是嗎
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推
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一般用kit或傳統方法甚至trizol純化 多少會有rnase殘留
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這應該大家都可認同,在dnase處理時會加rnase inhibitor
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這種情況在37度反應下 rnase活性似乎沒有這麼高
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但在65度下 rnase活性似乎會很強 (不知道是哪隻rnase)
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之前做測試 不管是否加入dnase或dnase inhibit solution
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RNA都會嚴重degrade 但手上沒有"真正純"的RNA
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所以很難證明究竟是RNase在65度下活性大增
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還是說RNA在65度下會degreade (已排除dnase或buffer汙染)
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RT時也有一步將RNA加熱至65度 姑且相信65度不會使RNA分解
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只能推測RNase於65度活性增強(印象有看過國外討論有提到)
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推
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最後還是用PCI/CI 管他有RNase DNase 一次清光光就沒問題
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另外 從此之後抽RNA都沒刻意放在冰上 一般室溫操作都沒事
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經過純化後在室溫下 RNase活性沒有想像中的強 so...
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09/12 19:38, , 62F
上面這句違反正道...為求保險 好孩子不要學XD
09/12 19:38, 62F
推
09/14 00:54, , 63F
跟對面實驗室打好關係～他們在抽的時候就過去看一下就好了XD
09/14 00:54, 63F
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09/15 09:15, , 64F
Staph破菌是關鍵 試試加完enzymes後37度C 15-20分鐘再抽
09/15 09:15, 64F
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09/17 09:07, , 65F
結果是KIT的問題，因為傳統法有做出來!
09/17 09:07, 65F
推
09/17 12:09, , 66F
要廠商退錢!!!!
09/17 12:09, 66F
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