[求救] 請問ligation
大家好...
剛剛爬了文...參考了很多人ligation的作法
不過我有一點疑問
我是用PGEM_T vector (promega) 3k
insert DNA 2K,比例vector:insert=1:4
經藍白篩之後, clone的數量也是很少><
ligation是 16度 overnight
想請問大家以下的問題:
1.pcr產物一定要先經過純化嗎?
問這個主要是因為我記得碩士clone時好像沒將pcr產物純化
直接和pgem t vector做ligation
不過在現在的實驗室要,想請問有無純化真的有差別嗎?
因為我gel extraction的濃度會變的很低
一開始pcr會p大概五管左右,再全部濃縮成50μl
跑膠完其實band還蠻清楚的,但是gel elute完後再取約2μl跑膠
band很弱,做了兩次都一樣,實在不知道問題是什麼
是用QIA的KIT去純化的
所以想問問看是否一定要先經過純化?
2.gel extraction為何濃度會那麼低呢?
都是造protocol去操作的, 到底問題是....?
先謝謝大家了,遲遲clone不出來好沮喪啊>"<
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