[求救] protein purification
請問一下各位不知道是否有遇過這樣的情況呢?
在表現的時候
我的vector是pET15b,用E.coil BL21(DE3)
在500ml TB,OD600約1.0的環境下
用0.5mM ITPG, 1mM PMSF,10uM FeCl3和d-ALA在20度C下去induction 15hrs
基本上overexpression是沒有問題
破菌完的crude extra及pellet去跑膠
都可以看得出來protein絕大部分都在supernatant中
但是一進FPLC純化
(用的是5ml HiTrap Ni-NTA column,過程中壓力都約在0.05~0.1MPa)
除了在0%,2%,6%及10%wash (100% =500mM imidazole)的位置有280nm的吸收peak以外
就沒有明顯peak的出現了
(20-100%的gradient wash 吸光值都差不多)
(flow through有一點點,可能是column overloading,
0%,2%,6%及10%wash也有跑page,全都是雜protein)
試了數次也都是一樣的情況
目前我有想了數個情況
(1) his tag掉了?
但是try induction條件前才定序過,應該機率不高吧
(2) 500mM imidazole仍elute不下來?
his tag會bind的這麼緊嗎
(3) 這個protein不喜歡這個buffer吧?
我用的是25mM Tris-Cl, 500mM NaCl,10mM MgCl2, 1mM PMSF, 5mM 2-ME,pH7.4
基本上這個pH和2-ME 對Ni-column的work是沒有太大影響
打得落落長
不知道有人有相似的經驗能做個分享嗎
感謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 59.126.12.177
※ 編輯: Marriott 來自: 59.126.12.177 (01/22 21:09)
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