[求救] cytosol及membrane protein extration

看板Biotech (生命科學)作者kenshinsandy (開心聽金屬˙ε˙)時間15年前 (2011/02/27 03:18)推噓0(0推 0噓 0→)

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最近需要將細胞cytosol及membrane bound的protein分離但是membrane的一直抽不出來或是抽的量都很低無法做western. 請各位大大們幫我看看是哪裡需要改進><"萬分感激! ------- Protocol: 1. 收細胞 (10cm dish滿盤收成一管) 2. 加sonication buffer A 洗一次，離心16,000g x 2min 2. 加sonication buffer B (100ul/管)，進行sonication把細胞震破 (震30秒停30秒，共10分鐘) 3. 超高速離心100,000g x 40min，收上清 →(為cytosol soluble protein) 4. 加sonication buffer C (50ul/管)，suspension pellet，插冰20min 離心16,000g x 20min，收上清 →(為membrane protein) --------------- 過程中有幾個小問題請教一下： (1) 超高速離心後的pellet根本無法用50ul就suspension起來，我都用tip把pellet刮出來... (只用50ul是怕加太多最後抽出的蛋白太稀...) 但是我看網路上trubleshooting有人說加太少可能會不足以溶出蛋白 (我配的buffer C有Triton X-100) →所以到底要用多少體積才夠溶呢~"~??? (2) 超高速離心完的pellet雖然刮出來了，但是就算vortex也無法完全打散該怎麼辦呢? (Vortex 10秒，插冰10秒，持續8min/管，雖然有打散一些變濁，但仍有小團塊) →目前自己覺得最可疑的應該是這邊抽不好~"~a --------------- 跪求高手幫我解惑 <(_ _")> 小妹感激不盡ㄒ_ㄒ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 111.240.174.93