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[求救] site-directed mutagenesis做不出來

看板Biotech (生命科學)作者時間15年前 (2011/03/31 15:28), 編輯推噓3(3推 0噓 15→)
留言18則, 7人參與, 最新討論串1/1
作者: even2300471 (pheaseat) 看板: Biotech 標題: [求救] site-directed mutagenesis做不出來 時間: Thu Mar 31 15:28:07 2011 這次實驗一共要做五種mutant mutate的位置都是一樣的 所有實驗都是一起進行 結果其中四組都做出來了 最後一組重複了三次在ampicillin-agar plate上仍然沒有長任何colony 五組使用的enzyme, buffer等等理論上都是一樣的 卻獨獨這組做不出來 不曉得有沒有人能提供經驗可能的原因是什麼 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.55.237
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03/31 16:01, , 1F
你PCR完有沒有跑膠? 確認一下有沒有P到東西吧
03/31 16:01, 1F
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03/31 17:25, , 2F
protocol上說 因為產物量太少 跑膠可能看不到band
03/31 17:25, 2F
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03/31 17:26, , 3F
但並不代表就沒有東西... 所以感覺跑膠意義不大?
03/31 17:26, 3F
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03/31 18:33, , 4F
我做的話會跑膠,而且會有band說...
03/31 18:33, 4F
推
03/31 20:54, , 5F
primer可能剛好有2級結構吧 不然沒道理只有它做不出
03/31 20:54, 5F
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03/31 20:58, , 6F
我之前經驗是 pfu與competent cell效率蠻重要
03/31 20:58, 6F
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03/31 20:59, , 7F
試試看commercial的competent cell
03/31 20:59, 7F
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04/01 16:22, , 8F
我用的的確是commercial competent cell沒錯
04/01 16:22, 8F
※ 編輯: even2300471 來自: 140.112.4.192 (04/01 16:25)
推
04/01 16:51, , 9F
會跑一下 但是沒有band一樣會繼續做XD 因為真的量不多
04/01 16:51, 9F
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04/01 16:51, , 10F
另外這狀況最直接的想法就是primer有問題吧
04/01 16:51, 10F
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04/01 16:52, , 11F
之前卡過一次卡了兩個月 reorder primer後做一次就出來
04/01 16:52, 11F
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04/01 16:53, , 12F
因為你有其他組同時做 等於已經幫你確認buff pfu跟cell
04/01 16:53, 12F
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04/01 16:53, , 13F
應該沒有大問題 所以檢查看看primer吧
04/01 16:53, 13F
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04/02 20:08, , 14F
感謝 我的想法其實跟樓上一樣...
04/02 20:08, 14F
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04/04 14:39, , 15F
除了step2 annealing才不會做跑膠 check,不然還是會做
04/04 14:39, 15F
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04/04 14:39, , 16F
產物應該是看的到吧 Q.Q
04/04 14:39, 16F
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04/04 14:40, , 17F
不過照你敘述 也覺得是 primer 有問題 +1
04/04 14:40, 17F
推
04/09 02:12, , 18F
有跑膠比較看看PCR與nonPCR的band有不同嗎?
04/09 02:12, 18F
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