[求救] 硫酸銨沉澱中蛋白質回收的問題

看板Biotech (生命科學)作者chong (CW)時間15年前 (2011/04/16 11:24)推噓2(2推 0噓 8→)

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最近在實驗室中做乳酸菌中蛋白質萃取實驗，我們是用發酵槽發酵乳酸菌，加入1% lysozyme進行破菌，再以硫酸銨沉澱從上清液中收取蛋白質。收集到蛋白質後，用Bio-Red的Duo flow跑離子交換樹脂。通常一次發酵能獲得30g的菌泥，我把它分成2部分，每1部分加300ml tris(ph8)，再加入3g lysozyme，於4℃冰箱中反應2小時。 →由於lysozyme剛加到tris buffer中時，不會馬上溶解，而且容易形成塊狀，實驗室其他人覺得可以先將lysozyme配成溶液後，再加到含菌的tris buffer中，這步驟會影響破菌的效果嗎？反應2小時後，離心22500g、30分鐘、4℃，收集上清液，然後開始做硫酸銨沉澱。實驗室用的是JT.backer的硫酸銨，顆粒有點大，所以我會先用研缽磨碎，才加到上清液中，加的時候緩慢加，可是我覺得很難保證每次做這實驗時的手法都很固定，有時候可能加稍微快一點，有時候會稍微慢一點，就是緩慢將那些粉末加到上清液中，然後讓它繼續攪拌，接著離心收集沉澱物。現在最大的問題就在於每批硫酸銨沉澱後的蛋白質，跑完離子交換樹脂後，獲得的圖譜不完全一致，pick高低會有落差，可是實驗室大老闆要求每批蛋白質跑ion exchange的pick都要一致，才能將它們混合以進行後續實驗。因為在後續實驗中，有打算進行動物餵食實驗，所以需要較大的量。因為之前做硫酸銨沉澱的人已經不在實驗室，所以我們是自己摸索著做，造成ion exchange的pick不一致的原因，會是硫酸銨沉澱造成的嗎？想請教有這方面經驗的人，能否給點意見？謝謝。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 124.219.13.192