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[求救] real-time qPCR

看板Biotech (生命科學)作者 (Lu-lin)時間15年前 (2011/04/17 18:40), 編輯推噓4(4推 0噓 22→)
留言26則, 3人參與, 最新討論串1/1
大家好,我使用的儀器是real-time qPCR,進行環境中特定細菌的定量分析. 使用的reagents是TaqMan peobe, Roche probe master. 起初,發現檢量線於低濃度的Ct值上不去,會漸漸趨於平緩而非高濃度呈等比放大. 且,NTC明顯與趨於平緩的Ct值相近(約35-36),很明顯就是被汙染了. 我後來以兩種方式配置reagents: 1.將各種試劑單獨加於每個well,發現NTC值不見了,表示reagnets應該沒有被汙染吧! 但是,檢量線低濃度部分仍然上不去. 2.將每個well的reagents先配置於eppendorf內,再分裝. 結果,NTC全部都跑出來了,且數值皆為35-36之間. 另外,檢量線低濃度部分也上不去,數值也約為35-36. 我tip和pipetman都有更換過了呀! 可是,仍然找不到原因:( 想請問專業的大家,可以給我什建議作為改善嗎? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.217.48.153
推
04/17 21:59, , 1F
不懂檢量線低濃度是甚麼意思? 另外total cycle數是多少?
04/17 21:59, 1F
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04/17 22:36, , 2F
序列稀釋高濃度至低濃度(0.01fg)，總cycle為50,謝謝!
04/17 22:36, 2F
推
04/17 22:57, , 3F
可能要看過raw data才能確認是甚麼狀況
04/17 22:57, 3F
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04/17 22:58, , 4F
但我個人覺得 NTC與低濃度跑出來的35-36的數值
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04/17 22:59, , 5F
曲線又沒有好的斜率 有可能是primer dimer自己放大的產物
04/17 22:59, 5F
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04/17 23:00, , 6F
或是probe與primer之間的反應
04/17 23:00, 6F
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04/17 23:02, , 7F
嗯 有可能是 primer dimer 跑個膠看看位置是不是很低
04/17 23:02, 7F
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04/17 23:03, , 8F
或是用軟體比看看有沒有機會出現 primer dimer
04/17 23:03, 8F
推
04/17 23:04, , 9F
而不是真正target造成的訊號
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04/17 23:04, , 10F
不知你有沒有跑melting curve的圖 也許可以參考
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04/17 23:06, , 11F
另外濃度低到0.01fg可以說是超過real time PCR的極限了
04/17 23:06, 11F
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04/17 23:07, , 12F
primer&probe找不到目標 就跟NTC一樣結果
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04/17 23:07, , 13F
然後primer & probe自己亂搞了起來
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04/17 23:08, , 14F
謝謝mattmatt很快速的回覆我!可是我使用的是TaqMan probe
04/17 23:08, 14F
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04/17 23:09, , 15F
是不是不會有primer dimer的問題發生?且不須要跑melting
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04/17 23:09, , 16F
若老板可接受primer dimer訊號的話 這個結果算是正常現象
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04/17 23:09, , 17F
若不接受的話 就考慮換primer & probe了
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04/17 23:10, , 18F
curve? 可是以前學姊還可以跑到0.001fg!!因為是環境監測
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04/17 23:11, , 19F
還是有機會有 有可能是primer dimer產物先被放大
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04/17 23:11, , 20F
好死不死probe剛好會去hybrid到 到後面幾輪訊號就出現了
04/17 23:11, 20F
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04/17 23:11, , 21F
所以濃度的要求都要很低,補充以前學姊的Ct值可以到40.
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推
04/17 23:14, , 22F
請問是Roche Lightcycler 毛細管機型嗎....?
04/17 23:14, 22F
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04/17 23:16, , 23F
也謝謝Anvec的建議!
04/17 23:16, 23F
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04/17 23:18, , 24F
不,是Roche480
04/17 23:18, 24F
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04/17 23:20, , 25F
而且,現在很怪的是reagent配置的方式也會影響NTC的結果.
04/17 23:20, 25F
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04/17 23:21, , 26F
但,我又不可能每次跑80多個樣本都一個well一個well加試劑
04/17 23:21, 26F
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