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[求救] Lentivirus infection效果...

看板Biotech (生命科學)作者 (停止流動的心)時間14年前 (2011/06/27 02:47), 編輯推噓7(7推 0噓 11→)
留言18則, 6人參與, 最新討論串1/1
目前我使用跟附近實驗室拿的pLenti4-CPO2 plasmid想要 overexpression 我的蛋白，另外則是用中研院的pMDG& delta 8.91 6 well 比例3:0.3(pMDG):2.7(8.91) :Lipo2000(12ul) 6hr changer medium 48&72hr後都各收一次soup infection時有+ploybrene&離心2500rpm 30mins 24hr後重新infect 一次 在24hr後換10%FBS讓他長。 另外我也有產eGFP Virus(同lenti4 Backbone)來當control 結果我有用螢光去觀察eGFP表現其實都有表現但是亮度都不強 我用western去偵測我目標蛋白也是偵測不到，但是我用HA可以偵測到(我Plasmid有掛HA) 目前已經排除是Ab問題(我transfect 可以偵測到)。時間點已經收到96hr了.. 請問各位學長們有沒有什麼建議好讓我增加titer...快不能畢業了orz -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 120.126.64.30
推
06/27 05:29, , 1F
病毒可以高速離心濃縮 => 救你現在的supernatant
06/27 05:29, 1F
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06/27 05:29, , 2F
長久之計就是... 從transfect開始optimize你的protocol
06/27 05:29, 2F
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06/27 05:31, , 3F
如果都OK 那可能就要換shuttle vector或接強的promoter
06/27 05:31, 3F
推
06/27 05:33, , 4F
亮度不強是跟誰比? transient transfection?
06/27 05:33, 4F
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06/27 08:42, , 5F
嗯回樓上是用同種GFP virus infect 293T比
06/27 08:42, 5F
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06/27 08:43, , 6F
有什麼建議optimize protocol嗎@@
06/27 08:43, 6F
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06/27 12:53, , 7F
跟原實驗室拿他們的package plasmid跟protocol
06/27 12:53, 7F
推
06/28 06:57, , 8F
用低代數的細胞 會有差 cDNA表現的病毒蠻難做的 我也搞很久
06/28 06:57, 8F
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06/28 06:59, , 9F
titer都會比shRNA的低很多 只能用離心濃縮提高titer
06/28 06:59, 9F
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06/28 12:48, , 10F
離心濃縮 不是要買kit?
06/28 12:48, 10F
推
06/28 15:51, , 11F
peg即可
06/28 15:51, 11F
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06/28 16:19, , 12F
小弟不才 啥是peg@@"
06/28 16:19, 12F
推
06/28 16:58, , 13F
可以google "PEG6000"看看
06/28 16:58, 13F
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06/28 17:50, , 14F
嗯有查到了...但是網路上的做法都很模糊XD
06/28 17:50, 14F
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06/28 17:50, , 15F
有人可以分享一下濃縮的流程嗎@@"
06/28 17:50, 15F
推
06/28 21:22, , 16F
293T養到morphology怪怪的就不要用了 會影響titer
06/28 21:22, 16F
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06/28 21:54, , 17F
給我信箱 我寄給你protocol..
06/28 21:54, 17F
推
06/29 13:21, , 18F
我是用20000rpm,4度C,2小時濃縮的.
06/29 13:21, 18F
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