[求救] 收磷酸化蛋白問題

看板Biotech (生命科學)作者 (JPG)時間14年前 (2011/11/07 13:50), 編輯推噓5(509)
留言14則, 5人參與, 最新討論串1/1
我目前是在做病毒相關的實驗 用病毒感染細胞後收取蛋白看細胞的表現 最近因為實驗需求需要收磷酸化蛋白~做western 要看eI2a與PERK是否有被磷酸化現象 我的時間點有3、6、9、12、24、36、48小時時間點 我想請問有沒有人試過將細胞以PBS wash完後冰到-80度 之後再一起以RIPA buffer+protease phosphotase inhibitor收下 不知道這方法可不可行? 這樣對磷酸化蛋白會不會有所影響? 還是建議時間點到就單盤單盤收下之後放-80度? 麻煩有做收過類似時間點的人幫我解答一下 感謝萬分~ -- ˋ ˋ φhacoolman 在這邊簽個名, / \ 不簽嗎不簽嗎 就能實現願望喔! / \ 簽嗎不簽嗎 │ │ 簽嗎不簽嗎 不簽嗎不簽嗎不簽嗎不\ │ 嗎不簽嗎 不簽嗎不簽嗎不簽嗎不簽 \ ︶︶ / 嘿~嘿~嘿~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.48.124

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我是收下以後進行IP 但都是新鮮做 不冰^^"
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我是都用RIPA收下來之後冰-80,然後等所有時間點都收齊再做
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實驗
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同上 inhibitor記得要加
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不同時間加藥,一起收
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可是聽說不同時間加藥,有人會介意加藥時細胞不是在同一個條
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件下進行實驗,不過如果時間沒有差很多我是覺得沒差
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phospho-protein最好要用細胞凍-80度 不要用protein lysate凍
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即使有加 phosphotase inhibitor的lysate
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有些比較敏感的phopho-protein 一樣會掉
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你所說的方法 比較好 只是記得 要把上清液吸乾一點
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當然 新鮮做最好 不過 還是先去冰-80度
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確保所有時間點的細胞都被凍住了 (約五-十分鐘) 再拿出來lyse
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做time course放冰上關signal是不夠的.有些apoptosis訊號會出
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文章代碼(AID): #1Ejt6p6f (Biotech)
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