[求救] HUVEC抽RNA

看板Biotech (生命科學)作者bigtuna (深海大鯊魚)時間14年前 (2011/12/11 23:39)推噓1(1推 0噓 9→)

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各位版友好每次做HUVEC時都看不到沉澱，這樣算正常嗎?我是6well(2.5X10^5養一天) 然後這次抽RNA時覺得怪怪的，定量時RNA濃度不夠希望專家可以幫我解惑，或步驟可以改善的，謝謝^___^ 下面是抽RNA的步驟 (抽RNA) 1.加Tri reagent 500 uL 2.用刮勺刮下細胞 3.收至eppendorff，室溫靜置5 min 4.加chloroform 100 uL，vortex vigorously 25-30s, 4度C靜置5 min 5.離心: 12000g, 4度C, 15 min 6.吸上清液220 uL至新eppendorff 7.加Isopropanol 220 uL, vortex mildly 25-30s, 4度C靜置5 min 8.離心: 12000g, 4度C, 10 min 9.倒掉上清液，加500 uL 75% EtOH, 輕微搖eppendorff數次 10.離心: 7500g, 4度C, 5 min 11.重複9, 10步驟一次 12.移至hood airdry 15-20 min 13.加DEPC-H2O 5 uL回溶 14.定量RNA濃度想請問一下是不是第十步離心轉速的問題(要調至12000g?) 去網路找protocol和自己實驗室的步驟有一些差別之前做HUVEC的學長畢業了想問一下大家的看法，感激不盡 -- -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.220.23.42

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huuban

12/12 14:15, , 1^F

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huuban

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huuban

12/12 14:16, , 3^F

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huuban大你好 Sample量以5 uL回溶最多在500 ng/uL左右(之前測的) 細胞量大概是在八九分滿就會開始做了(Starve 8小時) 因為之前做都看不到沉澱，我會在定量RNA時用tip來回攪拌,讓它均勻(輕微，沒有排空氣) 所以轉速應該不會影響到RNA sample吧(之前很納悶為什麼看到的protocol都是7500g的) 如果不影響的話那小弟就先試試看了謝謝你Orz ※ 編輯: bigtuna 來自: 120.126.85.122 (12/12 22:42)