[求救] 以BL21 pET29a 方式表現蛋白
第一次發文 請見諒
我是想要用pET29a insert 一段我想要表現的protein
pET29a 利用EcoRI, NotI 來切割
PCR product 同樣
DNA(plasmid) 1ug
RE10xbuffer 2ul
BSA 0.2ul
EcoRI,NotI 0.5ul*2
sH2O to 20ul 37度 2hr 65度 15mins inactivation
pET29a 及PCR product 以RE切完 跑膠純化
以Nanodrop 測濃度 大約已pET29a:PCR=1:5 比例去做ligation overnight
接著加入 BL21 competent cell 約 5ul
冰上30mins
42度 heat shock
+SOC 1hr
塗在LB plate 含Kana (40ug/ml)
長出的菌我以 T7primer 去做colony PCR 都無法夾到
我是有推測出幾個問題
plasmid我以T7primer 去夾是OK的
沒有insert時回夾出300bp的大小
我ligation的plasmid都是7~800bp (表示insert是成功的)
BL21 competent cell 是我自己做的 (第一次做, 且實驗室沒人做過)
我一開始推測我的competent cell有問題
所以後來我有去用我們家買的commercial 的DH5alpha 將我做的plasmid送入
竟然沒長!
我會想要做這個方式是因為畢業的學長做過，但是聽說他是因為plasmid有問題
他也是try很久才做出來，我現在很confuse
plasmid用T7primer去夾 應該是是正確的
但是用兩種competent cell 都無法正常的transformation
有好心人可以指點嗎 卡一陣子了 很需要這個data= =
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◆ From: 140.120.209.85
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