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[求救] qPCR測試結果疑惑

看板Biotech (生命科學)作者時間14年前 (2012/02/06 20:40), 編輯推噓2(2推 0噓 9→)
留言11則, 5人參與, 最新討論串1/1
因為實驗需求，自己設計了一段qPCR用的新primer 由於用的是SYBR GREEN的KIT， 所以收到primer後就先測試是否為單一產物 用的機器是BIO-RAD的 CFX96， 機器有內建protocol會幫你從預設的Tm值上下抓總共8個溫度 這張圖為我跑出來的結果(A->H依序為57度->45度)： http://img12.imageshack.us/img12/2705/qpcr.jpg
溫度較高的幾組都有兩個peak， 而隨著溫度越來越低右邊的那個peak就越來越小 到了最後那三個溫度就剩下單一peak，為單一產物 就圖來解釋變成隨著annealing溫度越低、primer專一性越高 怎麼跟我所學的PCR完全不一樣...沒道理啊！ 本來以為是我把溫度順序看反了， 但仔細看了protocol真的是A為57度然後H 45度... 有沒有對qPCR熟悉的前輩能幫忙解惑一下呢？ (在跑qPCR前有用一般的PCR跑膠完確認為單一片段，也無dimer產生) -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 114.44.200.136
推
02/06 20:52, , 1F
Ct 值呢？
02/06 20:52, 1F
→
02/06 20:57, , 2F
這是用來測primer專一性的protocol，為全部跑40 cycle
02/06 20:57, 2F
→
02/06 20:58, , 3F
後再分析melt curve，所以沒有Ct值
02/06 20:58, 3F
推
02/06 23:53, , 4F
melting curve不能說明哪個peak是你要的product吧
02/06 23:53, 4F
→
02/07 10:42, , 5F
送個定序...或是用限制酶切看看...
02/07 10:42, 5F
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02/11 10:24, , 6F
你可以修改裡面設定的potocol，在annealing和extesion
02/11 10:24, 6F
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02/11 10:28, , 7F
設定偵測，Tm值也可以增加，我設定從50~70，溫度太高
02/11 10:28, 7F
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02/11 10:30, , 8F
primer會黏不上去，太低也會亂黏，搭配Ct值你可以找出
02/11 10:30, 8F
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02/11 10:31, , 9F
適當的annealing 溫度
02/11 10:31, 9F
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02/11 10:34, , 10F
出現兩個peak..再去BLAST確定這對primer有沒有可能夾
02/11 10:34, 10F
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02/11 10:35, , 11F
別的產物
02/11 10:35, 11F
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