[求救] miRNA做real-time
各位好，小弟最近在做miRNA的real-time，遇到點問題請教...
1. 目前我個人的作法是Total RNA抽出來(TRIZol)，取定量(約5ug)做
polyadenylation (用polyA polymerase + ATP, NEB)，之後直接取1/10體積
用Oligo dT轉RT (SuperScriptIII, Invitrogen)。之後產物cDNA去跑real-time
Control都會用U6，目前為止都很穩定，但是miRNA的表現卻很跳痛。
該高不高，該低不低，重複的樣本也會上上下下。實在很難定量分析。
想請問有沒有更好的方法？
2. 有一說是RT用stem-loop primer去做類似RACE，會有比較高的專一性
對於mature vs. precursor miRNA比較能做(結構上的)區分。
不知道板上先進的建議是？
3. 目前小弟使用KAPA的2X master mix，機器是StepOne plus，
某些target容易跑出multiple Tm peak，salesperson是給我建議說
把reagent再稀釋些，這麼做難道還要try稀釋條件？還是有個大略值呢？
幾個問題請教，還請高手協助～喔耶～
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這個嘛...
http://aceliang.pixnet.net/album
http://www.wretch.cc/album/
http://123.342.123.321.231.321
選哪個好呢？
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 220.135.72.79
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