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[求救] histone的western blot

看板Biotech (生命科學)作者 (元元)時間14年前 (2012/04/02 16:27), 編輯推噓3(3推 0噓 8→)
留言11則, 5人參與, 最新討論串1/1
我們要看的是non phospho-H2AX sample 都是whole cell lysate, 然後顯色我們是用ECL, non phospho-H2AX一直都沒有band internal control我們用beta actin 有非常清楚的band transfer buffer我們用的是: 25mM Tris-base, 192mM glycine, 20% methanol, pH8.3 膜用的是0.45 um pore size 的 PVDF tansfer time: 250 mA, 2 hr 我看到histone的PI值好像是9, 10左右 所以主要原因是transfer buffer的pH值問題嗎? 或是0.45 um這個膜的pore size太大? 我如果調高transfer buffer的pH是不是又會影響其他protein的transfer? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.121.239
推
04/02 17:41, , 1F
當你sds上去後pi啥鬼都一樣 PVDF不會 你可以試試不同
04/02 17:41, 1F
→
04/02 17:41, , 2F
說不定是extraction的問題，用PSB煮就可以確認了
04/02 17:41, 2F
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04/02 17:43, , 3F
家Ab或者可以拿到純H2AX protein去證明你的一抗問題
04/02 17:43, 3F
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04/02 17:43, , 4F
或者抽核蛋白 因為一般lysis buffer(沒加sds)不容易
04/02 17:43, 4F
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04/02 17:44, , 5F
把histone從DNA上扯下來 最直接方法就是細胞收好加
04/02 17:44, 5F
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04/02 17:45, , 6F
1X sample buffer煮一煮離心跑膠（跟你的lysis比
04/02 17:45, 6F
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04/02 20:52, , 7F
可以參考abcam的抽histone的方法
04/02 20:52, 7F
推
04/03 19:00, , 8F
做過磷酸化的,抗體是Abcam的樣子,似乎不難壓~
04/03 19:00, 8F
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04/04 22:14, , 9F
樓上有做磷酸化的話不是也都會做非磷酸化的當做
04/04 22:14, 9F
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04/04 22:14, , 10F
control嗎? 就是"total的H2AX"
04/04 22:14, 10F
推
04/05 13:54, , 11F
因為沒錢買普通的...
04/05 13:54, 11F
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