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[求救] Trizol前可以用PBS wash?

看板Biotech (生命科學)作者 (Sky)時間14年前 (2012/04/06 22:00), 編輯推噓3(3推 0噓 6→)
留言9則, 7人參與, 最新討論串1/1
我們實驗室是用trizol來抽cell line RNA,依說明書說加入前不要用PBS wash cell 問題在加入萃取物處理細胞後,抽出的RNA pellet似乎都會有殘留萃取物(灰綠色), 雖然用nanodrop測出來的量、260/280、260/230都算正常, 但不知道為什麼某些組萃取物會導致跑qPCR時,18S都莫名其妙少了快兩個CT, 我推測是因為萃取物會與RNA共沉澱,導致RTase的活性被抑制,使得RT沒那麼好 因為已經做了三次實驗,某幾組萃取物都有同樣的結果,應該不是實驗人為誤差 雖然說CT值都勉強在線性範圍內,但總覺得有點毛毛的. 查了網路上,有lab protocol說加入trizol前要cold PBS wash, 有人表示colde PBS wash後,抽出的RNA表現量會大亂, invitrogen也說wash後會導致RNA degradation. 請問到底能不能用PBS wash呢? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.218.97
推
04/06 23:54, , 1F
用PBS wash為什麼會導致degrade? 細胞又還沒破....
04/06 23:54, 1F
http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf 我也很好奇，在第二頁寫到 Do not wash cells before addition of TRIzol® Reagent to avoid increased chance of mRNA degradation. ※ 編輯: libraq 來自: 140.112.218.97 (04/07 00:05)
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04/07 01:31, , 2F
我們家是invitrogen的Trizol有分別試過有無PBS的wash步驟
04/07 01:31, 2F
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04/07 01:31, , 3F
realtime結果還算正常
04/07 01:31, 3F
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04/07 01:37, , 4F
我猜會不會Cold PBS會產生Cold shock~所以不建議使用
04/07 01:37, 4F
推
04/07 03:01, , 5F
我分離b細胞..分離過程很多PBS wash最後還是可以抽RNA
04/07 03:01, 5F
推
04/07 09:51, , 6F
是怕洗太大力會破掉? 反正能不洗就不洗
04/07 09:51, 6F
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04/12 00:59, , 7F
怕是PBS裡有RNase吧 若真的有 殘留一點就有差了
04/12 00:59, 7F
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04/12 01:00, , 8F
不過我從來都沒有看過灰綠色殘留物... 這裡問題比較關鍵
04/12 01:00, 8F
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04/12 01:49, , 9F
謝謝大家,最後還是洗了,也找了些paper,找到可能問題的部份
04/12 01:49, 9F
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