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[求救] total Akt的量不一

看板Biotech (生命科學)作者 (Azusa)時間14年前 (2012/04/19 02:05), 編輯推噓11(11推 0噓 22→)
留言33則, 7人參與, 最新討論串1/1
最近在做Akt的western blot時發現， total Akt的量似乎會受處理影響(induced apoptosis)， 但理論上處理應該只會影響Akt的活化量， (每個lane間loading control-actin的量也一致) 看paper上total Akt的量都一樣， 實在不知道是他們的處理不會影響total Akt， 還是跑膠後，重新調整過total Akt的量。 不知道有沒人有經驗在壓p-Akt和total Akt時遇到類似的問題呢? 謝謝~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 59.121.5.64
推
04/19 11:08, , 1F
actin一樣嗎
04/19 11:08, 1F
推
04/19 12:46, , 2F
total包含phospho，phospho有變動理論上total就會有變動
04/19 12:46, 2F
→
04/19 12:47, , 3F
只是因為常常non-phospho比phospho多很多，所以total看起
04/19 12:47, 3F
→
04/19 12:48, , 4F
來沒差。也就是說，total有變動是沒關係的
04/19 12:48, 4F
推
04/19 12:50, , 5F
可能你的細胞本身Akt就不多，所以total看的出差異
04/19 12:50, 5F
→
04/19 13:48, , 6F
P有變動理論上total就會變動？ total只是P與non-P的總合阿
04/19 13:48, 6F
→
04/19 13:52, , 7F
要是total是隨著phospho變化，那phospho就這件事就不重要了
04/19 13:52, 7F
推
04/19 15:29, , 8F
抱歉我想修正"理論上"這三個字，用的不恰當
04/19 15:29, 8F
→
04/19 15:31, , 9F
應該說"有可能"，我們必須考慮轉譯出新的non-p的可能性
04/19 15:31, 9F
推
04/19 15:38, , 10F
整理："T不變、P有變" 和 "T隨P而變(同增同減)" => 合理
04/19 15:38, 10F
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04/19 15:38, , 11F
後者如果遇到non-P可"抑制"，P可"促進"的情形
04/19 15:38, 11F
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04/19 15:38, , 12F
可以用P/T ratio的定量結果去解釋
04/19 15:38, 12F
推
04/19 15:43, , 13F
如果non-P"無功能"，P可"促進"，只看P的結果即可
04/19 15:43, 13F
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04/19 15:44, , 14F
前提當然是loading control藥一樣
04/19 15:44, 14F
推
04/19 15:48, , 15F
最簡單的作法是，全部都用P/T raio去看摟，不過定量挺
04/19 15:48, 15F
→
04/19 15:48, , 16F
麻煩的
04/19 15:48, 16F
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04/19 22:42, , 17F
total actin是接近一樣的! 我目前也是採用定量看ratio
04/19 22:42, 17F
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04/19 22:43, , 18F
去看差異，只是納悶是只有我這樣~還是這情形普遍會發生~
04/19 22:43, 18F
→
04/19 23:14, , 19F
有時候是因為你apoptosis太嚴重造成
04/19 23:14, 19F
→
04/19 23:14, , 20F
actin訊號強所以看不出太大差異,但AKT就會有差
04/19 23:14, 20F
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04/19 23:15, , 21F
另外推F大的 P/T ratio
04/19 23:15, 21F
推
04/19 23:37, , 22F
我也有幾個PROTEIN會這樣，不過不是Akt
04/19 23:37, 22F
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04/20 00:15, , 23F
謝謝大家的幫忙~那我就先用ratio看了~請問大家遇到這種
04/20 00:15, 23F
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04/20 00:17, , 24F
情形，若是有發表需要，是不是就直接按照total Akt量調整
04/20 00:17, 24F
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04/20 00:17, , 25F
loading，再跑出漂亮的結果呢??
04/20 00:17, 25F
推
04/20 00:20, , 26F
不行啊，loading的protein量一定要一樣
04/20 00:20, 26F
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04/20 00:24, , 27F
要怎樣調整或定量校正，取決於你要強調的點,因此有些data
04/20 00:24, 27F
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04/20 00:25, , 28F
不放loading control而用total取代以強調phospho的差異
04/20 00:25, 28F
推
04/20 13:06, , 29F
我有遇過 可以考慮drug treatment時間短些
04/20 13:06, 29F
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04/20 13:06, , 30F
對於mRNA Protein的變化 Post-modification 更能在短時間
04/20 13:06, 30F
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04/20 13:07, , 31F
內看到變化 所以如果很堅持想讓tAKT一樣 那就別treat太久
04/20 13:07, 31F
推
04/20 23:20, , 32F
感謝大家的討論 我也遇到類似的問題
04/20 23:20, 32F
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04/21 22:18, , 33F
謝謝大家幫忙!我會先再嘗試看RATIO或把處理時間縮短看看
04/21 22:18, 33F
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