[求救] internal ctrl出不來

看板Biotech (生命科學)作者ElmoPU (pupu)時間14年前 (2012/05/07 00:01)推噓3(3推 0噓 5→)

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最近遇上了怪事進行western blot 無論是跑學姊的sample 或是我自己的sample GAPDH怎麼樣就是出不來或是很弱 (壓片1分鐘還是淡到不行,以往10秒就超強 1st Ab是1:8000,2nd Ab是1;10000) 但是其他的蛋白就都可以detect到甚至改壓beta-actin就出的來 (所以確認並非sample本身有問題) 本來學姊推論是否是小於40kD都出不來可能是running或transfer bfr有問題 (因為我剛好有配新的,懷疑可能有配錯) 但是我向其他人借了bfr跑出來跟以往一樣有一個14kD的蛋白一樣可以detect到而且signal還很強所以顯示並非小於40kD就無法detect 1抗也換過5支了而且都是別人確定是work的 2抗也有換過了我實在不知道還有哪裡可能會有問題... 有可能是washing bfr嗎? 但是這樣不是應該整片都有問題? 而那個range(約莫26-43kD)去hybrid另一個測phosphorylation的1抗即使是壓片1秒也是一片黑但是別人用同樣的抗體就不會有可能是我哪個環節出了問題才導致這個問題的產生呢? PS半個月之前,一切都很ok,GAPDH都很美麗的阿.... 這段期間,washing和transfer bfr有重新配過stock 然後Tris pH8.8也有補充有換的東西應該就只有這三樣已經確認running和transfer bfr應該是沒問題的 (因為用別人的跑一樣壓不出GAPDH) 請問有人知道有什麼會造成這問題嗎? 謝謝!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 118.169.215.217