[求救] 急！問ROCHE TUNEL Fluorescein KIT
大家好，我目前已經購買ROCHE TUNEL Fluorescein kit這一組
我想請教一些問題！
我的組織是腦切片，前面有先用灌流（PFA）後有脫水，目前已經冷凍
切片了（40um一片）
因為實驗室或者鄰近的實驗室（我們所很小只有五個老師＠＠）沒有人使用這組kit
或者沒人做tunel所以沒人可以請教，所以想問有使用過這組kit的人，拜託了！
已經準備好的切片，我看他的protocol如下（框內有我想問的問題）
先用PFA固定
(問題1.我的切片已經用PFA固定是否還要做此步驟？)
用PBS WASH，為了保存請用純酒精在低溫-15~-25度讓切片脫水
（問題2.是否一定要做此步驟？因為我的切片已經用3%蔗糖脫水過）
使用Permeabilisation solution 於冰上反應兩分鐘
（問題3.這個solution的配方為0.1% Triton X-100, 0.1% sodium citrate，
請問這個配方中的sodium citrate作用為何？？是泡在PBS中嗎？
問題4.因為我還要染BrdU也是螢光染色，前面步驟需使用0.1% Triton X-100 in PBS
想請問同時染BrdU and TUNEL這個增加細胞膜的步驟，是否只需要一次？而且使用
0.1% Triton X-100 in PBS 即可？因為唯一差別在sodium citrate上）
接下來有疑惑的地方
(問題5.他protocol寫tissues 是用一種方法，如果是difficult tissues又是另一種
方法，雖然他有寫difficult tissues為dewax paraformaldehyde- or formalin tissue
但是不知道我之前處理我的切片時，是否也屬於這個difficult tissues？？）
我先問一般tissue方法：
用PBS RINSE兩次，之後將切片周圍弄乾，加入TUNEL REACTION MIXTURE，在蓋上蓋玻片
後放於37度避光狀態下反應一小時
（問題6.我們的切片染色一組約14片同時放在同一個WELL染，我看TUNEL REACTION
MIXTURE用量極少，PROTOCOL又寫把周圍用乾，是否因為要將切片先貼在玻片上？
問題7.他說TUNEL REACTION MIXTURE為 enzyme solution取50ul label solution取
450ul 這個量可以做10個sample ，所以一個sample只需要50ul，但是我的腦切片面
積很小，只需要10ul後蓋上蓋玻片，即可將液體均勻分佈！所以是否我取
enzyme solution：label solution ＝ 1:9 最少量為10ul就夠了？？怕減少量會降低
效果）
用pbs wash 三次，後放到螢光顯微鏡即可觀察到
（問題8.此時再把切片從玻片上取下放到well清洗嗎？？）
不好意思，第一次使用也沒人可以教...很多問題，希望能有所解答！
因為內容很多，希望直接寄站內信給我！非常感謝><"拜託大家了！！！
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