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[求救] 有人用recomobination方法clone的嗎

看板Biotech (生命科學)作者 (sylvia)時間13年前 (2012/07/19 22:29), 編輯推噓1(1推 0噓 6→)
留言7則, 3人參與, 最新討論串1/1
要做一個clone一直出不來（insert中間有ccdb sequence，兩端序列相像） 試過傳統方法，也有blunt end，但一直求不到 後來試了recombination的kit (genescript的clonEZ以及neb的gibson) 之前試其他的clone有成功過，但這次怎麼樣都出不來 方法是在vector先切成linear，再用兩端有vector序列的insert去recombine 我的vector是雙切後做gel purify insert pcr後有做gel purify 再根據kit做，但還是出不來阿～～～～～～～（這個clone我做了三個月阿～～～～） 想請問有用過此方法的高手有什麼該注意的地方 還有recombine的地方離切位多遠就會失敗？ 感恩～～～～！！！！！！！！！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 118.166.193.9
推
07/19 22:50, , 1F
有ccdB的話，competent cell是關鍵。
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07/19 22:51, , 2F
這類的kit也有Vivantis的Flex-C可以選擇~
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07/19 23:30, , 3F
compent cell我是用invitrogen的ccdb t1～所以應該沒
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問題～
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用yeast
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E. coli recombination其實不是很穩
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07/20 23:10, , 7F
然後 你弄的應該不是一般sequence吧?AT rich, repeated seq?
07/20 23:10, 7F
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